Isolierung von mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit EAE

Summary

In diesem Video zeigen wir, wie man mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis isolieren.

Abstract

Ob das Studium eine Autoimmunerkrankung gerichtet an das zentrale Nervensystem (ZNS), wie experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE, 1), oder die Immunantwort auf eine Infektion des ZNS, wie Kinderlähmung, Lyme Neuroborreliose oder Neurosyphilis, ist es oft notwendig, um die ZNS-infiltrierenden Immunzellen zu isolieren.

In diesem Video-Protokoll zeigen wir, wie man mononukleären Zellen (MNC) aus dem ZNS der Ratte mit EAE zu isolieren. Der erste Schritt dieses Verfahrens erfordert eine kardiale Perfusion der Nager mit einer Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass kein Blut in den Blutgefäßen Bewässerung des ZNS bleibt. Jede Kontamination mit Blut wird künstlich erhöhen die Anzahl der scheinbaren ZNS-infiltrierenden multinationalen Unternehmen und kann die scheinbare Zusammensetzung des Immunsystems zu infiltrieren ändern. Wir haben dann zeigen, wie das Gehirn und das Rückenmark der Ratte für nachfolgende Kanalkrümmung entfernen, um ein Single-Cell-Suspension herzustellen. Diese Suspension wird auf einem Zwei-Schicht-Percoll-Gradienten getrennt, um die Multis zu isolieren. Nach dem Waschen werden diese Zellen dann bereit, alle erforderlichen Verfahren zu unterziehen.

Mononukleären Zellen isoliert mit diesem Verfahren sind lebensfähig und können für die Elektrophysiologie, Durchflusszytometrie (FACS), oder der Biochemie eingesetzt werden. Wenn die Technik unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird (unter Verwendung von sterilen Instrumenten in einer Gewebekultur Haube) können die Zellen auch in Gewebekultur gezüchtet werden. Eine bestimmte Zellpopulation kann weiter gereinigt werden entweder mit magnetischen Trennverfahren oder eine FACS.

Protocol

Tief betäuben Ratten. Spray mit 70% Ethanol und machen Sie einen kardialen Perfusion mit PBS für 10 min, um Zellen aus den Blutgefäßen (cut dem rechten Vorhof und perfuse durch den linken Ventrikel) zu entfernen. Entfernen Sie die Gehirn und Rückenmark und in ein 50 ml Röhrchen mit eiskaltem PBS. Schneiden Sie die Gehirn und Rückenmark in einem 70 mm Zellsieb in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml eiskaltem PBS gelegt. Drücken Sie jedes S…

Discussion

Dieses Verfahren, da alle Verfahren mit lebenden Tieren, muss von Ihrer Institution Tier Nutzung und Pflege Ausschuss genehmigt werden. Wir empfehlen, einen Tierarzt oder eine tierärztliche Techniker anwesend sein bei der Durchführung der ersten Herz-Infusionen auf ein ausreichendes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten ist, um das Tier vor und während des Verfahrens gegeben, und dass die Tiere nicht unterziehen unnötige Schmerzen oder Leiden.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14190-250
Cell strainer, 70 um	Tool	Fisher	08-771-2
Percoll	Reagent	Sigma	P1644