Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen
Summary
Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).
Abstract
Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.
Introduction
Eisigen Temperaturen, die beim Pflanzen aktiv wachsenden auftreten kann tödlich sein, vor allem, wenn die Anlage hat wenig oder keine Frosttoleranz. Solche Frost Ereignisse haben oft verheerende Auswirkungen auf die landwirtschaftliche Produktion und können auch eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Gemeinschaftsstruktur in natürlichen Populationen von Pflanzen, vor allem im alpinen, subarktischen und arktischen Ökosysteme 1-6. Episoden starker Frühlingsfrösten haben große Auswirkungen auf Obstproduktion in den USA und Südamerika in den letzten Jahren 7-9 hatten und wurden von der frühen Beginn der warmen Wetter, gefolgt von mehr typische mittlere niedrigen Temperaturen verschärft. Die frühe warme Wetter induziert Knospen zu brechen, aktivieren das Wachstum der neuen Triebe, Blätter und Blumen, die alle sehr wenig bis gar keine Frosttoleranz 1,3,10-12 haben. Solche unberechenbar Wettermuster sind berichtet worden, um eine direkte Reflexion der fortschreitenden Klimawandel und erwartet, dass sie ein gemeinsames Wettermuster für die fores seineeable Zukunft 13. Die Bemühungen um die wirtschaftliche, effektive und umweltfreundliche Management-Techniken oder Agrochemikalien, die eine erhöhte Frosttoleranz bereitstellen kann einen begrenzten Erfolg für eine Vielzahl von Gründen, hatte aber das kann teilweise auf die Komplexität der Frosttoleranz und Gefriervermeidungsmechanismen in Pflanzen zurückgeführt werden. 14
Die adaptiven Mechanismen mit Frost Überleben in Pflanzen assoziiert sind traditionell in zwei Kategorien eingeteilt, das Einfrieren und Gefriertoleranz Vermeidung. Die erste Kategorie ist mit biochemischen Mechanismen, durch eine bestimmte Gruppe von Genen, die Pflanzen, die Spannungen mit der Gegenwart und der dehydratisierende Wirkung von Eis in seinen Geweben tolerieren ermöglichen geregelt verbunden. Während die letztere Kategorie ist typischerweise, aber nicht ausschließlich, mit strukturellen Aspekte einer Pflanze, die, wenn zu bestimmen, wann und wo sich Eis in einer Pflanze 14 verbunden. Trotz der Prävalenz von freeze Vermeidung als Ad-aptive Mechanismus hat wenig Forschung in der letzten Zeit für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und Regulation der Gefriert Vermeidung gewidmet. Der Leser wird auf eine aktuelle Übersicht 15 für mehr Details zu diesem Thema verwiesen.
Während die Bildung von Eis bei niedrigen Temperaturen kann wie ein einfacher Prozess erscheinen, viele Faktoren tragen zur Bestimmung der Temperatur, bei der Eis Keime in Pflanzengewebe und wie es breitet sich in der Anlage. Parameter, wie die Anwesenheit von extrinsischen und intrinsischen Eiskernbildnern heterogene vs. homogene Keimbildung, thermische Hysterese (Frostschutz) Proteine, das Vorhandensein von spezifischen Zucker und anderen Osmolyten, und eine Vielzahl von strukturellen Aspekte der Anlage spielen eine bedeutende Rolle des Gefrierprozesses in Pflanzen. Gemeinsam beeinflussen diese Parameter die Temperatur, bei der eine Pflanze friert, wo Eis initiiert und wie es wächst. Sie kann auch Auswirkungen auf die Morphologie der resultierenden Eiskristallen.Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um den Gefrierprozeß in Pflanzen, die unter Laborbedingungen, einschließlich kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) 16, Kernspintomographie (MRI) 17, Kryo-Mikroskopie 18-19 und Tieftemperatur-Rasterelektronenmikroskopie Studie (LTSEM ). 20 Freezing ganzer Pflanzen im Labor- und Feldeinstellungen hat sich jedoch hauptsächlich mit Thermoelementen überwacht. Die Verwendung von Thermoelementen, um ein Einfrieren zu studieren ist an der Freisetzung von Wärme (Schmelzwärme), wenn das Wasser einen Phasenübergang von einer Flüssigkeit zu einem Feststoff basiert. Einfrieren wird dann als exotherme Ereignis aufgezeichnet. 21-23 Obwohl Thermoelemente sind das typische Verfahren der Wahl bei der Untersuchung Gefrier in Pflanzen hat ihre Verwendung vielen Einschränkungen, die die Menge an Informationen während eines Gefrier Ereignis erhalten begrenzen. Zum Beispiel mit Thermoelementen ist es schwierig, fast unmöglich, zu bestimmen, wo das Eis in Pflanzen angezogen, wie sie ausbreitet,wenn es breitet sich mit gleichmäßiger Rate, und wenn einige Gewebe eisfrei bleiben.
Fortschritte in der hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) 24-27 haben jedoch deutlich erhöht die Fähigkeit, Informationen über den Gefrierprozess in ganzen Pflanzen zu erhalten, vor allem, wenn in einem Differential Imaging-Modus verwendet. 28-33 In diesem Bericht haben wir beschreiben die Verwendung dieser Technologie, um verschiedene Aspekte des Gefrierprozesses und verschiedene Parameter, die beeinflussen, wo und bei welcher Temperatur und Eis in Pflanzen begonnen zu studieren. Ein Protokoll vorgestellt werden, die die Fähigkeit des Eis-Nukleation aktive (INA) Bakterium Pseudomonas syringae (Cit-7) als extrinsische Nukleator Einleitung Einfrieren in eine krautige Pflanze auf einem hohen, unter Null Temperatur handeln demonstrieren wird.
Hochauflösende Infrarot-Kamera
Das Protokoll und die Beispiele in diesem Bericht dokumentiert nutzen eine hochauflösende Infrarot-Video-Radiometer. Das Radiometer (1) liefert eine Kombination von Infrarot- und sichtbaren Spektrums Bilder und Temperaturdaten. Die spektrale Empfindlichkeit der Kamera ist im Bereich von 7,5 bis 13,5 um und liefert 640 x 480 Pixel Auflösung. Sichtbaren Spektrums erzeugt Bilder durch die integrierte Kamera mit IR-Bilder in Echtzeit, was die Auslegung komplexer, Wärmebilder erleichtert fusioniert werden. Eine Reihe von Linsen für die Kamera verwendet werden, um Nahaufnahmen und mikroskopische Beobachtungen zu machen. Die Kamera kann in einem Standalone-Modus verwendet werden, oder eine Schnittstelle mit einem Laptop mit propietary Software gesteuert. Die Software kann verwendet werden, um eine Vielzahl von in den aufgezeichneten Videos eingebettet thermische Daten zu erhalten. Es ist wichtig anzumerken, dass eine Vielzahl von Infrarot-Radiometer sind kommerziell verfügbar. Daher ist es wichtig, dass die Forscher über ihre vorgesehene Anwendung mit einem erfahrenen Produktingenieur und dass der Forscher testen die Fähigkeit eines spezific Radiometer, um die erforderlichen Informationen zur Verfügung stellen. Das bildgebende Radiometer in der beschriebenen Protokoll verwendet wird, in einem Acryl-Box mit Styropor i n, um die Exposition während der Erwärmung und Abkühlung Protokolle, um Kondensation abzuschrecken isoliert (Abbildung 2) platziert. Dieser Schutz wird nicht für alle Kameras oder Anwendungen benötigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wasser hat die Fähigkeit, auf Temperaturen von weit unter 0 ° C und der Temperatur, bei der Wasser gefriert können ziemlich variabel sein, zu unterkühlen. 36 Die Temperaturgrenze für die Unterkühlung von reinem Wasser beträgt etwa -40 ° C und wird als die homogene Keimpunkt definiert. Wenn Wasser gefriert bei Temperaturen wärmer als -40 ° C wird durch die Anwesenheit von heterogenen Keimbildnern, dass gebracht ermöglichen kleinen Eis Embryonen zu bilden, die dann als Katalysator für die Bildung vo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P23681-B16: Diese Arbeit wurde vom österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) finanziert.
Materials
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
Referências
- Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
- Neuner, G., Hacker, J., Lütz, C. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. , 163-174 (2012).
- Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? – Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
- Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D., Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. , 1-11 (2009).
- Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
- Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
- Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
- Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, 1031-1039 (2007).
- Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
- Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
- Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
- Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
- Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
- Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
- Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
- Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
- Ishikawa, M., Sakai, A., Li, P. H., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. , 325-340 (1982).
- Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
- Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
- Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
- Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
- Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
- Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
- Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
- Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
- Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
- Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
- Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
- Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
- Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
- Wisniewski, M., Fuller, M. P., Margesin, R., Schinner, F. . Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. , 105-118 (1999).
- Franks, F. . Biophysics and biochemistry at low temperatures. , (1985).
- Neuner, G., Kuprian, E., Hincha, D., Zuther, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. , 91-98 (2014).
