Immunofärgning att Visualisera Murin enteriska nervsystemet Utveckling
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
En fungerande enteriska nervsystemet (ENS), som kontrollerar motilitet, absorptionen av näringsämnen, och lokalt blodflöde, är nödvändigt för liv 1. Den ENS bildas av neurallist celler (NCC) som förökar sig, migrera och kolonisera tarmen, där de differentiera till ganglier innehåller neuroner och gliaceller. Hirschsprungs sjukdom (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), en multigeneic medfödd sjukdom med en incidens på 1 på 4.000 levande födda, kan anses vara prototypiska sjukdomen för att studera störs ENS bildning. I HSCR NCC inte att migrera till och kolonisera varierande längder av den distala hindgut 2. Dessutom är andra vanliga gastrointestinal (GI) utvecklings defekter i den pediatriska populationen, såsom anorektala missbildningar, tarm atresias och motilitetsstörningar i samband med störningar i grundläggande ENS funktioner, och sannolikt i samband med subtila, underappreciated, anatomiska förändringar och funktionella förändringar iENS 3-6. Därför kan tekniker som gör det möjligt för oss att förstå utvecklings faktorerna för ENS bildning belysa patogenesen och potentiell behandling av pediatriska GI vägssjukdomar.
Efter migration och kolonisation, skiljer NCC till nervceller med markörer som är specifika för deras signalsubstans fenotyp. Kolinerga neuroner utgör cirka 60% av enter neuroner 7, och kan detekteras genom färgning för kolinacetyltransferas (chatt), den syntetiserande enzym för den excitatoriska neurotransmittorn acetylkolin. Historiskt, försök att visualisera kolinerga neuron förvirrad av olika antigen specificitet antikroppar riktade mot centrala nervsystemet (CNS) ChAT kontra perifera nervsystemet (PNS) ChAT 8-10. Men antikroppar riktade mot placental ChAT erkänna både centrala och perifera ChAT 11-13, och vi har nyligen beskrivit tekniker som gör det möjligt för videoanläggningsering av ENS kolinerga neuron med hög känslighet tidigare i utvecklingen än vad som uppnåtts med chatt reporter linjer 14.
Här presenterar vi en teknik för att dissekera, fastställande och immunfärgning av mus embryonala mag-tarmkanalen för att visualisera ENS signalsubstans uttryck i nervceller. För dessa studier har vi använt ChAT-Cre möss parat sig med R26R: floxSTOP: tdTomato djur att producera ChAT-Cre, R26R: floxSTOP: tdTomato möss (definierade som chatt-Cre tdTomato hela manuskriptet). Dessa djur sedan parades med homozygota ChAT-GFP reporter möss, för att erhålla möss som uttrycker både fluorescerande reportrar att upptäcka ChAT uttryck 14. Dessa två reporter djur är på en C57BL / 6J bakgrund, och är kommersiellt tillgängliga (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt laboratorium och andra har visat att tarm defekter i HSCR inte är begränsade till den aganglionic kolon men förlängdes proximalt, även i ganglionated tunntarmen 5,15,16. Dessa förändringar innefattar förändringar i ENS neuronal densitet och signalsubstans fenotyp och kan redogöra för dysmotilitet som har observerats hos patienter med HSCR. Vi har använt ovanstående tekniker i vår strävan att förstå faktorerna för ENS bildning. Specifikt har dessa tekniker använts för att visualisera …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes bythe amerikanska Pediatric kirurgiska Association Foundation Award (AG) och National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
