적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경
Summary
프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.
Abstract
혈액은 비 뉴톤 biofluid로서, 혈액 류 분야에서 많은 연구의 초점을 나타낸다. 혈액 성분은 적혈구, 혈장에 현탁 백혈구 및 혈소판을 포함한다. 인해 적혈구 풍부 (혈액량의 40 % 내지 45 %)로, 그들의 동작은 특히 미세 혈액의 유동 학적 거동을 지시한다. 매우 낮은 전단 속도로, 적혈구는 조립 볼 수 있습니다 및 양식 개체는 혈액의 비 뉴턴 동작이 발생하는 집계를했다. 그것은 미세에서 혈액 유 동학을 이해하는 골재 형성의 조건을 이해하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 프로토콜은 화상 처리에 기초하여, 일정한 전단 속도하에 정량적 미세에서 RBC 응집체를 결정하기 위해 실험적인 방법에 대해 설명. 이를 위해, RBC-현탁액 시험 120 X 60 ㎛의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로 분석. RBC-현탁액은 천만에 있습니다혈액 층 내의 선형 속도 프로파일을 구함으로써 일정한 전단 속도의 넓은 범위를 달성하기 위해 제 2 유체를 이용한 비가. RBC 응집체가 고속 카메라를 사용하여 시각화하는 동안 전단 속도는 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. RBC 집합체 캡쳐 영상은 이미지 강도에 기초하여 상기 골재 크기를 결정하기 위해 화상 처리 기술을 이용하여 분석한다.
Introduction
적혈구 세포 (적혈구)는 혈액의 유동 학적 거동을 결정하는데 중요한 역할을한다. 그들은 거의 유일하게 생체 외 및 생체 내에서 혈액의 특정 속성에 대한 책임이 있습니다. 생리 학적 조건 하에서, 적혈구는 혈액 부피의 40 % 내지 45 %를 차지한다. 미세에서는 적혈구에만 의한 작은 혈관의 직경과 효과 1 감추고 플라즈마 혈액 부피의 20 %까지 차지한다. 미세 플라즈마 감소의 이러한 현상은 Fåhræus 효과로 알려져있다. 저 전단 속도에서, 적혈구, 따라서 혈액의 비 뉴톤 거동에 기여 함께 메우고 "연전 현상"또는 응집체라는 차원 1 인 또는 3 차원 구조를 형성 할 수있다. 그러나, 적혈구 응집 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 두 이론은 적혈구의 응집을 모델링 존재 : 세포 이론 브리징 인해 거대 분자 (2)의 가교 및 힘에 attrac기 이론 인해 삼투압 구배 3 분자의 고갈에 의해 발생.
일반적으로, 인간의 피를, 단위는 1에서 10 초 -1에 이르기까지 매우 낮은 전단 속도 4에 형성한다. 이 범위보다, 적혈구는 해리하는과 용기 내에서 개별적으로 흘러 경향이있다.
골재 형성의 조건을 이해하면 혈액의 유동 학적 거동을 정의의 관점에서 혈액 류 분야에 매우 중요하다. 이 집계는 종종 macrocirculation 레벨 (> 300 μm의 직경) (5)에서 볼 수 있습니다. 이 규모에서, 혈액은 뉴턴 유체 및 균일 한 혼합물로 간주됩니다. 그러나, 이러한 응집체는 거의 모세관 레벨 (4-10 μm의 직경)에 보지되고 일반적으로 당뇨병 및 비만과 같은 6 병리 적 상태의 표시이다. 적혈구 응집 염증 또는 감염 조건을 포함 변경할 수있는 다른 병적 인 조건,고혈압이나 동맥 경화, 유전 질환 및 만성 질환 (7)과 같은 심혈관 질환. 따라서, RBC의 응집 메카니즘을 이해하고 (이들 골재와 유동 조건의 크기 간의 관계를 정의함으로써) 이러한 엔티티를 분석하는 혈액 microrheological 동작의 이해로 이어질 수 있으며, 이에 따라 임상 적 적용에 관한 것이다.
RBC 응집체는 이러한 헤마토크릿 (혈액 내의 적혈구 용적), 전단 속도, 혈관 직경, RBC 막 강성과 현탁 매질 조성물 8-10와 같은 여러 요인들에 의해 변경 될 수있다. 따라서, 제어 된 조건을 효과적으로 RBC 응집체를 분석하기 위해 요구된다. 몇몇 방법들은 혈액 동작에 대한 관련 정보를 제공하는 정전기 응집 측량 (응집 지수)를 제공함으로써 골재 형성을 분석 할 수있다. 이들 방법은, 특히 적혈구 침강 속도를 포함방법 (11), 광 전송 방식 (12), 광 반사 방법 (13) 및 저 전단 점도 제 14.
몇몇 연구는 적혈구 응집을 연구하고 제어 흐름 조건 15-17에서 집계 된 정도를 확인하려고했습니다. 그러나, 이들 연구는 간접적 응집의 정도뿐만 아니라 로컬 점도에 대한 정보를 제공하는 미세한 혈액 화상에 기초하여 측정 전단 시스템에서 차지하는 공간의 비율을 결정함으로써 RBC에게 골재 크기를 조사.
따라서 우리는 직접 적혈구가 통제되고 일정한 전단 속도에 따라, 동적, 미세에 집계 정량화 할 수있는 새로운 방법을 제시한다. 인산 완충 식염수 (PBS) 용액이 때문에 혈액 층 전단 유동을 생성하여, (도 1에 도시 된 바와 같이) RBC 현탁액-Y-마이크로 이중에서 비말 동반된다. 이 혈액 내에서 일정한 시어 레이어R 율을 얻을 수있다. RBC-현탁액은 다른 헤마토크릿 (H) 레벨 (5 %, 10 % 및 15 %)에서와 상이한 전단 속도 (초 -1 2-11)에 따라 시험한다. 혈액의 속도와 전단 속도는 흐름이 고속 카메라를 사용하여 시각 동안 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. 얻어진 결과는 다음 적혈구를 검출 골재 크기를 결정하기 위해 이미지 강도에 기초 MATLAB 코드로 처리된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 방법을 이용하여, 정량적으로 분석 할 수있다 정량적 RBC 다른 유동 조건 하에서 헤마토크릿 집계. 성공적인 시험 및 골재 검출 들어, 마이크로 엔트리에서 두 유체 사이에 적절한 속도 비를 결정하는 데 중요하다. 이 비율은 속도 프로파일 19 준 선형 최적 혈중 층 두께를 얻기 위해 매우 중요하다.
성공적인 테스트를위한 또 다른 중요한 요소는 좋은 이미지 품질입…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. 미세는 맥길 대학 맥길 나노 장비 Microfab 시설과 칼턴 대학에서 전자 공학학과의 지원으로 수행되었다.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
Referências
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