Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
La synthèse des protéines est un processus fondamental de l'expression du gène impact divers processus biologiques, notamment d'adaptation à des conditions environnementales. L'étape d'initiation, qui implique l'ensemble des sous-unités ribosomiques à l'ARNm codon d'initiation, facteur d'initiation impliqués y compris eIF4G1. Les défauts de ce taux étape limitante de la traduction sont liées à divers troubles. Pour étudier les conséquences potentielles de ces dérégulations, Xenopus laevis ovocytes constituent un modèle attractif avec des degrés élevés de conservation des mécanismes cellulaires et moléculaires essentiels avec l'homme. En outre, au cours de la maturation de la méiose, les ovocytes sont transcriptionnellement réprimés et toutes les protéines nécessaires sont traduits à partir préexistantes, ARNm maternels. Ce modèle peu coûteux permet ARNm exogène pour devenir parfaitement intégrés avec une traduction efficace. Ici, on décrit un protocole pour l'évaluation de la traduction avec un facteur d'intérêt (ici eIF4G1) en utilisant stored ARNm maternel qui sont les premiers à être polyadénylé et traduits au cours de la maturation ovocytaire comme une lecture physiologique. Dans un premier temps, l'ARNm synthétisé par transcription in vitro de plasmides d'intérêt (ici eIF4G1) sont injectés dans des ovocytes et la cinétique de maturation de l'ovocyte par la détection de panne Germinal vésicule est déterminé. La cible de l'ARNm maternelle étudié est la sérine / thréonine mos-protéine-kinase. Son polyadénylation et sa traduction subséquente sont étudiées conjointement avec l'expression et la phosphorylation de protéines des mos cascade impliqué dans la maturation des ovocytes de signalisation. Variations de l'actuel protocole à mettre en avant les défauts de traduction sont également proposées pour souligner son applicabilité générale. À la lumière de la preuve que la synthèse protéique aberrante peut être impliquée dans la pathogenèse de troubles neurologiques émergents, un tel modèle offre la possibilité d'évaluer facilement l'dépréciation et d'identifier de nouvelles cibles.
Introduction
Les protéines sont des éléments essentiels de la vie cellulaire et donc à plus grande échelle de l'organisme. Ils assurent la majorité des fonctions cellulaires, y compris la structure, le transport, la réaction de catalyse, la réglementation, l'expression des gènes, etc. Leur expression est le résultat d'un mécanisme complexe de traduction permettant la conversion d'un ARNm en protéine. La traduction est soumise à divers contrôles d'adapter et de réguler l'expression des gènes en fonction des besoins de la cellule, au cours de la différenciation et le développement, le vieillissement, les stress physiologiques ou manifestations pathologiques.
La traduction est divisé en 3 phases (initiation, l'élongation et la terminaison) et présente 3 systèmes de traduction d'initiation afin de répondre à ces besoins: cap-dépendante, coiffe-indépendante par l'intermédiaire interne des ribosomes Entrée Segment (IRES) structures et les exhausteurs de traduction cap-indépendante ( CITE).
La plupart des ARNm eucaryotes sont convertis dans un bouchon-dependent manière par la 7-méthylguanosine capuchon 5'-triphosphate qui sert de caractéristique de reconnaissance pendant la synthèse de la protéine. Ce bouchon se lie à eIF4E, un composant du complexe eIF4F avec eIF4G1 et eIF4A. Associé à d'autres partenaires tels que le poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-ARNt Met, ces facteurs d'initiation de traduction permettent de circulariser l'ARNm et améliorer son accessibilité à des formes complexes 43S jusqu'à ce que le codon d'initiation AUG reconnaissance 1. Cet événement correspond à la fin de l'à-dire d'initiation de traduction, la première étape de la traduction.
Traduction cap-indépendante est utilisée par les ARNm codant pour les protéines essentielles de conditions de stress qui provoquent la prolifération cellulaire et de l'apoptose de l'instance. Ce mécanisme comporte des structures secondaires dans l'ARNm 5 'non traduite (UTR) appelé IRES, l'extrémité carboxy-terminale de eIF4G1 associé à eIF4A et le complexe 43S. La liaison de ce 43S pré-initiation complex à IRES initie la traduction indépendante de cap sans la nécessité pour le facteur eIF4E 2,3.
Enfin, un autre mécanisme de translation pas encore bien compris soutient cette activité de traduction coiffe-indépendante dans des conditions stressées, par la CITE structures situées dans l'ARNm UTR 4.
Grâce à ces différents modes de traduction différant par leurs étapes d'initiation, la traduction joue un rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire et tout changement dans l'un de ces processus serait donc un impact sur l'organisme auprès des petites et grandes effets d'échelle. En effet, l'initiation est une étape limitante taux régissant les processus de traduction correcte de l'ARNm en protéines et est donc la cible de nombreux contrôles et des points 5 de régulation. Que ce soit pour ce dernier ou des composants de ces processus, si l'on se révèle être défectueux, il sera perturber l'équilibre établi dans la cellule et donc pourrait conduire à Condi pathologiquetions. Dans ce contexte, les mutations dans les facteurs de conversion ont été impliqués dans plusieurs maladies dont les maladies neurodégénératives telles que `leucoencéphalopathie avec fuite matter' blanc (eIF2B1-5 de sous-unité) 6, dans le syndrome de Walcott-Rallison (EIF2AK3 gène codant pour PERK) 7, éventuellement en maladie (eIF4G1 la p.R1205H) de Parkinson 8. Il est donc important de mener des études cellulaires et moléculaires de ces protéines mutantes d'accroître nos connaissances sur le développement de la maladie et sur le processus général d'initiation de la traduction.
Pour mener à bien ces études, il est essentiel de choisir les modèles les plus adéquats pour observer les conséquences de ces mutations ovocytes de Xenopus laevis sont particulièrement bien adaptés en raison de leurs propriétés physiologiques et biochimiques:. Synchronicité physiologique (bloqué en phase G2 du cycle cellulaire) , grande capacité de synthèse des protéines (200-400 ng / jour / ovocyte), nombre élevé de ooc extraitytes à partir d'un même animal (800-1000 ovocytes / femme) et la taille des cellules (1,2-1,4 mm de diamètre), qui facilite leur manipulation. Microinjection d'ovocytes de Xenopus avec synthétisé ARNm peut facilement être effectuée à disséquer étapes de traduction. Dans cette vue, il présente d'autres avantages. Compte tenu de la vitesse de progression de la méiose et de la traduction de l'ARNm après la micro-injection (~ 24 h), des ovocytes de Xenopus représente un système rapide par rapport aux systèmes reconstitués cellulaires de E. coli (extrait de germes de blé, ou de reticulocytes de lapin …) dans laquelle est un ARNm traduit par un taux de conversion réduit et à une vitesse inférieure. Ainsi, les effets d'une mutation introduite dans un ARNm seront rapidement et facilement observable étudié dans plusieurs ovocytes. Un autre avantage d'ovocytes de Xenopus est que les ARNm maternels sont latente et la traduction des protéines est bloqué avant la stimulation de la progestérone. L'addition de la progestérone est donc un bon moyen de commande de l'induction de la traduction. P cytoplasmiqueolyadenylation ne se produit pas lors de l'ovogenèse. Il commence au cours de la maturation ovocytaire dans des ovocytes de progestérone stimulée dans un ordre temporel et se poursuit durant le développement précoce et pourrait être utilisé pour étudier les différentes étapes de la traduction.
La polyadénylation du mos ARNm est parmi les premiers à se produire et il appartient à Aurora A / Eg2, Histone-Like B4 ARNm à la classe des gènes «maturation précoce» au sens de Charlesworth et al. (2004) 9. L'induction de la traduction de l'ARNm "tardives" tels que la cycline A1 et B1 cycline se produit autour du moment de la rupture de la vésicule germinale (GVBD). Mos ARNm code pour une sérine / thréonine protéine-kinase. Sa traduction est cruciale car elle induit la cascade de kinase MAP qui active indirectement la maturation de l'ovocyte. En effet, en réponse à la progestérone, la polyadénylation de l'ARNm mos est renforcée par un processus impliquant Aurora A / Eg2 protéines régulatrices et d'autres protéines de liaison d'ARN avec ee 3'UTR de l'ARNm mos. Cette augmentation de polyadénylation de l'ARNm mos conduit à une augmentation du niveau de protéine de mos, qui à son tour active MEK1. Ce processus médie l'activation de la kinase extracellulaire régulée de signalisation 2 (ERK2) (Figure 1). Cette cascade de signalisation peut alors déclencher la maturation phase M facteurs favorisant, un complexe formé par la cycline B kinase Cdc2 et, et, éventuellement, conduit à la reprise de la méiose.
Par conséquent, dans ovocytes de Xenopus laevis, l'étude de l'ARNm maternels tels que mos pourrait facilement être utilisé pour tester leur traductibilité avec plusieurs paramètres de leur polyadénylation efficace à la traduction de plusieurs composants MOS de signalisation, y compris également la détermination du taux GVBD. Ce système est donc intéressant d'évaluer les premières conséquences de mutations dans les facteurs d'initiation de traduction, sans ingérence de nouveaux ARNm transcrit ou de l'efficacité de transfection, les problèmes surviennent souvent avec eukaryétudes sur les cellules auriculaires.
Ici, un protocole est établi lorsque ARNm eIF4G1 mutantes sont micro-injectés dans des ovocytes de Xenopus laevis et la traduction de l'ARNm maternelle est testé. En présence d'un défaut de progression GVBD, mos ARNm polyadénylation qui est essentiel pour la progression à travers le cycle cellulaire méiotique des ovocytes et pour la traduction ultérieure des ARNm de classe précoces et tardifs est constatée. La phosphorylation Aurora A / Eg2 et ERK est également étudié pour confirmer la conséquence de mos deregulation.Thus, des ovocytes de Xenopus représentent un moyen simple d'analyser les différentes étapes de traduction de l'ARNm.
Protocol
Representative Results
Discussion
La traduction est un mécanisme impliqué dans la physiopathologie de nombreuses maladies humaines, y compris plusieurs maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie de Parkinson plusieurs rapports ont suggéré la déficience en translation associée à des mutations héréditaires 8,12,13.
Plusieurs modèles cellulaires sont disponibles pour étudier la traduction. Ici, dans le but d'étudier les conséquences d'une mutation de la traduction en eIF4G1 qui …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
Referências
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