Isolering och Kryokonservering av neonatala råttkardiomyocyter
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Cell kultur av hjärtmuskelceller är ett viktigt verktyg inom modern hjärtforskning. Neonatal råttkardiomyocyter (NRCMs) används vanligtvis eftersom isoleringen och kultur är lättare än för vuxna råttkardiomyocyter en. Den NRCM metoden har fortfarande flera begränsningar, inklusive en lång isoleringsförfarande och begränsad celltillväxt i skålen. Det finns många protokoll för isolering av NRCMs med mest allmänt kräver 4-48 tim arbete 2-6. Dessutom är cellerna ofta isoleras från 1 till 2 dagar gamla råttungar 2,4-7; tidpunkten för födseln kan vara oförutsägbara och konflikt med annat arbete i labbet. De isoleringar kan vara ineffektivt och oekonomiskt om endast en liten mängd celler som behövs för experiment. De flesta ansträngningar på att förbättra arbetsflödet fokus på att minska isoleringen tiden, men detta löser inte problemen med tids födelsen av valparna.
Som alternativ, många laboratorier utnyttjarkardiomyocyter härledda från embryonala stamceller (ESCS) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Emellertid kan omprogrammering och / eller differentiering processen vara mycket tidskrävande och kostsamt också. Det kan finnas andra problem när du använder dessa celler som in vitro myocyt modeller. Både ESC- och iPSC- härledda hjärtmuskelceller har visats uppvisa skillnader i elektrofysiologi från primära kardiomyocyter 8-10.
Dissocierade NRCMs är kan lagras i flera dagar med kylning 11, men detta gör det möjligt för långtidsförvaring. Flytande kväve används typiskt för att bevara celler under en längre tidsperiod, men kräver ett kryoskyddsmedel såsom dimetylsulfoxid (DMSO). Tidigare forskning har visat att den ideala koncentrationen mellan 5-10% DMSO i frysmedier möjliggör frysförvaring av NRCMs, men även då lönsamheten är fortsatt låg 12. Även DMSO skyddar cellerna under frizing, kan det vara toxiska för celler vid koncentrationer över 1,5% 13. Tidigare studier har visat att långsamt avlägsna DMSO från cellerna, kan förbättra cellviabilitet 14.
Vi sökte att förbättra effektiviteten i NRCM cellbaserade analyser genom cryopreserving cellerna efter isolering. Detta möjliggör för cellerna att tinas och användas när det är nödvändigt, vilket minskar frekvensen av isoleringar och konsumtion av djur. Med användning av denna metod, visar vi att det är möjligt att cryopreserve NRCMs och tina dem för användning vid ett senare tillfälle. Efter upptining cellerna bibehålla en acceptabel lönsamhet och producera NRCM kulturer som är positiva för α-sarcomeric actinin (α-SA) och kontrakts spontant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll möjliggör för NRCMs skall isoleras, frysförvarade, och tinas. Upptining av cellerna är en avgörande del av förfarandet. En serie DMSO utspädningar används för att sakta ut DMSO från cellerna 14. Det är viktigt att extraktionen av DMSO utföras snabbt när cellerna är särskilt känsliga för att dö omedelbart efter upptining. Om fler eller färre celler erfordras för upptining, kan volymerna av DMSO-lösningar skalas efter behov.
En utmaning till NRC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
Referências
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
