Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Resumo

Aqui, documentamos o uso do ensaio de formação de colônias de ágar mole para testar os efeitos de um inibidor da enzima peptidilarginina deiminase (PADI), BB-Cl-amidina, na tumorigenicidade do câncer de mama in vitro.

Resumo

Dadas as dificuldades inerentes à investigação dos mecanismos de progressão do tumor in vivo, os ensaios baseados em células, como o ensaio de formação de colônias de ágar mole (doravante denominado ensaio de ágar mole), que mede a capacidade das células de proliferar em matrizes semissólidas, continuam sendo uma marca registrada da pesquisa do câncer. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos ensaios convencionais de monocamada 2D ou cultura de células esferóides 3D é o mimetismo próximo do ambiente celular 3D ao observado in vivo. É importante ressaltar que o ensaio de ágar mole também fornece uma ferramenta ideal para testar rigorosamente os efeitos de novos compostos ou condições de tratamento na proliferação e migração celular. Além disso, este ensaio permite a avaliação quantitativa do potencial de transformação celular no contexto de perturbações genéticas. Recentemente, identificamos a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) como um potencial biomarcador de câncer de mama e alvo terapêutico. Aqui destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole para estudos anticâncer pré-clínicos, testando os efeitos do inibidor de PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), na tumorigenicidade de células de carcinoma ductal humano in situ (MCF10DCIS).

Introdução

Tanto as células não transformadas (normais) quanto as transformadas podem proliferar prontamente em uma cultura de monocamada 2D. Essa forma de crescimento celular aderente é bastante diferente daquela que ocorre in vivo, onde, na ausência de estimulação mitogênica, as células geralmente não se dividem rapidamente em seu microambiente. O ensaio de ágar mole, por outro lado, é distinto dos sistemas de cultura 2D porque quantifica a tumorigenicidade medindo a capacidade de uma célula de proliferar e formar colônias em suspensão dentro de um gel de agarose semissólido¹. Nesse cenário, as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidamente na ausência de ancoragem à matriz extracelular (MEC) e sofrem apoptose, um processo conhecido como anoikis. Em contraste, as células que sofreram transformação maligna perdem sua dependência de ancoragem devido à ativação de vias de sinalização, como fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Akt e Rac/Cdc42/PAK. Portanto, essas células são capazes de crescer e formar colônias dentro da matriz de ágar mole semi-sólido².

Um uso comum do ensaio de ágar mole é testar se compostos específicos, como inibidores de PADI, são capazes de suprimir o crescimento do tumor in vitro. Em geral, a contagem de colônias ou tamanhos de colônias são leituras quantitativas do ensaio que podem ser comparadas entre os grupos de controle e tratamento para avaliar as diferenças na tumorigenicidade celular. Portanto, se alguém descobrir que a formação de colônias está inversamente correlacionada com o aumento da concentração do medicamento, pode-se concluir que o medicamento é um inibidor eficaz da tumorigenicidade in vitro. Por outro lado, se o medicamento não afetar a formação de colônias, o medicamento não está na dosagem apropriada ou não é um inibidor tumorigênico eficaz. Além de usar um ensaio de ágar mole para testar o efeito antitumoral de um medicamento, este ensaio também pode ser usado para investigar a relação entre um gene específico e a tumorigênese. Por exemplo, o efeito da supressão da expressão de PADI2 na tumorigenicidade pode ser abordado pelo tratamento com siRNA específico para PADI2.

PADIs são enzimas dependentes de cálcio que modificam proteínas pós-traducionalmente convertendo resíduos de arginina carregados positivamente em citrulina carregada neutramente em um processo conhecido como citrulinação ou deiminação^3-5. Recentemente, descobrimos que a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) pode funcionar como um novo biomarcador de câncer de mama e que os inibidores de PADI representam terapias candidatas para câncer de mama em estágio inicial⁶. Por exemplo, demonstramos anteriormente que um inibidor "pan-PADI", Cl-amidina, suprime a proliferação de células de câncer de mama usando monocamadas 2D e que o inibidor suprimiu o crescimento de esferóides tumorais 3D⁶. Neste relatório, estendemos esses estudos e destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole, testando a eficácia de um novo inibidor de PADI, BB-CLA, na supressão do crescimento de MCF10DCIS colônias de câncer de mama⁷. Observamos que usamos células MCF10DCIS para este experimento porque são derivados oncogênicos de células MCF10A humanas não transformadas e porque contêm altos níveis de estado estacionário da proteína^{PADI2 8}. Nossa hipótese é que a atividade enzimática do PADI2 desempenha um papel fundamental na tumorigenicidade dessa linhagem celular e que a inibição da atividade do PADI2 mediada por BB-CLA suprimirá a progressão do câncer.

Protocolo

1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose

1. Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada.
2. Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose.
3. Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min.
4. Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA.

2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose

1. Pré-quente vários 5 ml e 10 ml pipetas num banho a 37 ° C para evitar a incubadora de agarose de solidificação na pipeta durante o manuseamento.
2. Parcialmente soltar a tampa do frasco e microondas a 3% de solução de pré-fabricados de agarose a 2-hidroxietil durante 15 seg. Em seguida, agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. CUIDADO: Tenha cuidado quando agitando o agarosolução se porque a solução sobe quando exposto ao ar e pode transbordar.
3. Se houver gel sólido residual no frasco, com microondas, durante mais alguns segundos.
4. Manter o frasco contendo a solução de agarose, num banho de 45 ° C a água durante os próximos passos para impedir que a solução de agarose de solidificação prematura.
5. Mídia MCF10DCIS quente em um banho de água a 37 ° C. Nota: meios MCF10DCIS consiste de DMEM / F12, 5% de soro de cavalo, 5% de penicilina estreptomicina.
6. Transferência de 3 ml da solução de agarose a 3% utilizando as pipetas pré-aquecido para uma estéril tubo de 50 ml.
7. Imediatamente adicione 12 ml de mídia MCF10DCIS quentes e inverter cuidadosamente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formam quaisquer bolhas que pode interferir com a contagem das colónias mais tarde.
8. Adicionar cuidadosamente 2 ml desta mistura para cada poço de uma placa de cultura de 6 cavidades, sem formar quaisquer bolhas de ar.
9. Incubar a placa de 6 poços de cultura horizontally sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante 1 h para permitir que a mistura de solidificar.
10. Após as mistura solidificar, colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. A camada inferior é agora pronto para o uso.

3. Preparação da Camada contendo celular: 0,3% do gel de agarose

1. Tripsinizar as células e dilui-los MCF10DCIS a uma concentração celular de 4 x 10 ⁴ / ml.
2. 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecida e transferir para um tubo de 50 mL estéril cónico.
3. Imediatamente adicionar 8 ml de mídia MCF10DCIS para o tubo cônico e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas.
4. 2 ml de células MCF10DCIS (4 x 10 ⁴ / ml) e trata-se com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
5. Em uma diluição de 1: 1, misturar as células com agarose a 0,6%.
6. Tomar 1 ml da mistura de células-agarose e adicionar suavemente sobre a camada de fundo da cultura de 6 poços ptardios (2 x 10 ⁴ células / mL).
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidificar.
8. Após as mistura solidificar, colocar a placa num incubador a 37 ° C durante uma semana antes de se adicionar a camada de alimentação.

4. Preparação da Camada de alimentador: 0,3% do gel de agarose

1. Microondas a 3% de 2-Hidroxietil solução de agarose pré-fabricados durante 15 seg. agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos.
2. Equilibrar o frasco de solução de agarose, num banho de água a 45 ° C.
3. Aquecer os meios MCF10DCIS num banho de água a 37 ° C.
4. Misture 1 ml de solução de agarose 3% com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo de 50 ml e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas de ar.
5. Tratar a mistura com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM).
6. Suavemente adicionar 1 ml desta mistura (sem paraming bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias.
7. Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura de solidificar.
8. Após a camada alimentadora solidifica, colocar a placa num incubador de 37 ° C.
9. Repetir este procedimento semanalmente alimentação sobrepondo 1 ml de solução de agarose / médio / tratamento de 0,3% para a camada de alimentação existente para repor as células com novos meios, até a formação de colónias é observado. Nota: Agar nas camadas moles e de alimentação é muito suave e, por conseguinte, os nutrientes adicionados a partir da camada de alimentação irá facilmente difundir-se na camada contendo as células para atingir as células.

5. Coleta de Dados

1. Depois de 2,5 semanas de crescimento celular no agar mole, contar o número de colónias em cada poço usando um microscópio de luz. Para facilitar a quantificação, imprimir uma grade em uma transparência e anexar a grade para o6-poços para ajudar a localizar onde as células são, durante a contagem. Uma vez que o tamanho da colónia (como quantificado por o diâmetro de cada colónia) irá variar, predefinir um tamanho de colónias de referência para determinar quais as colónias serão marcados. Por exemplo, incluem dimensões das colónias de 70 mm ou maior na análise de dados.
2. Armazenar as amostras a 4 ° C para evitar uma maior formação de colónias e de contagem futuro. Selar a placa de cultura de 6 poços com Parafilm para evitar que os géis de secar.

Resultados

O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição do crescimento do tum...

Discussão

A taxa de formação de colónias em agar mole varia dependendo do tipo de célula ^9. Portanto, o número de células para iniciar com deve ser optimizado e ajustado em conformidade. Uma gama de partida sugerida é de entre 5 x10 ² a 1 x 10 ⁴ culas por po numa placa de 6 poços. Além disso, o tamanho da colónia varia dependendo da taxa de crescimento de cada célula. Portanto, um pré-definido um limite para o tamanho da colónia é necessária para anotar colónias individuais para análises quantitat...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	Microscopia 1021859251 Zeiss Axiopot Carl Zeiss
2-Hidroxietilagarose: Tipo VII, baixa temperatura de gelificação	Sigma-Aldrich	39346-81-1

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