Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Rat adulte et les cellules humaines de la moelle épinière neurales souches / progénitrices (NSPCs) cultivées dans un milieu de croissance enrichi en facteur permet la prolifération des multipotentes, et les cellules souches neurales expansibles auto-renouvellement. Dans des conditions sérum, ces NSPCs multipotentes seront différencier, générer des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes,. Le tissu prélevé est enzymatiquement dissocié dans une solution de papaïne-EDTA et ensuite dissocié mécaniquement et séparés par un gradient de densité discontinu pour obtenir une suspension cellulaire unique, qui est plaqué dans un milieu neurobasal additionné de facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), et de l'héparine. Rats adultes de la moelle épinière NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants et adultes humains NSPCs de la moelle épinière sont cultivées comme cultures adhérentes. Dans ces conditions, adultes de la moelle épinière NSPCs prolifèrent, marqueurs expresses de cellules précurseurs, et peuvent être élargies en permanence lors du passage. Ces cellules peuvent be étudiée in vitro en réponse à divers stimuli, et des facteurs exogènes peuvent être utilisés pour promouvoir restriction de la lignée d'examiner la différenciation des cellules souches neurales. Multipotentes NSPCs ou leur progéniture peuvent également être transplantées dans divers modèles animaux pour évaluer la réparation régénérative.
Introduction
NSPCs cellules multipotentes sont commis à la lignée de neurones qui peut auto renouveler et élargir facilement in vitro. Nous nous référons à ces cellules comme une population mixte de cellules souches / progénitrices neurales car ils présentent des propriétés de cellules souches multipotentes auto-renouvellement et les progéniteurs plus restreints. NSPCs se trouvent à la fois dans le cerveau du fœtus et de l'adulte et la moelle épinière 1,2. Chez l'adulte, NSPCs sont normalement repos et résident dans des niches spécifiques, y compris la zone sous-ventriculaire qui tapisse les ventricules latéraux 2-4, et dans la région périventriculaire entourant le canal central de la moelle épinière de 5,6.
Typiquement, NSPCs sont cultivées comme neurosphères flottants ou comme monocouches adhérentes dans un milieu sans sérum supplémenté avec de l'EGF et bFGF, qui sélectionnent mitogenes pour les populations de cellules souches / progénitrices. Le dosage de neurosphère initialement développé par Reynolds et Weiss 2, est le plus couramment utilisé pour la culture etdévelopper des cellules souches neurales. NSPCs montrent multipotence quand ils sont étalées dans un milieu contenant du sérum exempt de facteur de croissance, se différencier en neurones, astrocytes, oligodendrocytes et. Multipotentes, NSPCs d'auto-renouvellement peuvent être isolés et mis en culture à partir du rongeur adulte moelle épinière lorsque le tissu en culture comprend les régions du canal central 6,7. Un avantage potentiel dans l'utilisation de NSPCs générées lors de la moelle épinière adulte, par opposition à générer des cellules provenant d'autres régions est que ces cellules spécifiques d'un tissu ressemblent plus étroitement les cellules de la moelle épinière qui sont perdues ou endommagées après une blessure ou d'une maladie.
Des travaux antérieurs ont montré que neurosphères dérivées de la moelle épinière adulte humaine ne pouvaient pas être propagées à long terme ou des passages pour générer un nombre suffisant de cellules 8,9. Cependant, avec des modifications dans des conditions de culture, nous avons signalé l'expansion et la transplantation de NSPCs adultes de la moelle épinière humaine dérivés, ce qui démontre que l'auto-renouvellementNSPCs multipotentes et peuvent être isolées à partir de moelle épinière de l'adulte humain de donneurs de transplantation d'organes 10. En premier lieu, l'élimination de la majeure partie de la matière blanche au cours de la dissection et la culture de ces cellules adhérentes sur un substrat dans un milieu de croissance enrichi en facteur choisi pour adultes humains en prolifération NSPCs de la moelle épinière. Dans ce protocole, nous décrivons la récolte de la moelle épinière de rats adultes et à partir de donneurs humains de transplantation d'organes, la dissection du tissu péri-ventriculaire, et l'isolement, la culture et l'expansion de NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de la dissection de la moelle épinière soins de tissu de rat doivent être prises pour ne pas endommager la moelle épinière tout en effectuant la laminectomie. Il est plus facile d'isoler le tissu périventriculaire lorsque les segments de la moelle épinière sont intacts. Les segments de tissus devraient être complètement immergés dans un tampon de dissection et les méninges recouvrant la matière blanche et peuvent être découpées en bandes longitudinales avec microciseaux. Alternativement, for…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
Referências
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