الماوس السذاجة CD4<sup> +</sup> عزل T خلية و<em> في المختبر</em> التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
مفهوم الأنساب متميزة أو مجموعات فرعية من CD4 + T المساعد وكانت (ث) خلايا موجودة منذ الجزء الأخير من القرن التاسع 20 1. الاعتراف مستضد وما شابه ذلك بحضور النتائج إشارات costimulatory في عدة جولات من انتشار الخلوي والتمايز في نهاية المطاف إلى المستجيب ث الخلايا. نوع ث الخلايا المولدة خلال هذه العملية يتوقف على البيئة خلوى الحالية خلال تفعيل 2. في البداية، كان يعتقد خلايا ث ساذجة لاستقطاب في 2 الأنساب المتميزة التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التنشيط، costimulatory CD28 ربط، وخلوى الإشارات. وتتميز نوع 1 الخلايا المساعدة (TH1) من خلال إنتاج المستجيب لها من خلوى IFNγ فضلا عن احتياجاتهما لIL-12 الإشارات خلال 3،4 عملية التمايز. في نهاية المطاف تم اكتشاف أن خلايا TH1 متباينة لديها الصورة الجينية التي تتميز معظم متميز بذ التعبير عن مربع T عامل النسخ الأسرة، Tbx21 (T-رهان)، والتي تعتبر المنظم الرئيسي للبرنامج جيني TH1 5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن IL-12 وكذلك IFNγ تعزيز T-رهان التعبير 6،7. في الاستجابة المناعية، وخلايا TH1 مهمة للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وكذلك المروجين قوي للالتهاب المناعة الذاتية. في المقابل، خلايا من النوع 2 المساعد (TH2) تتطلب IL-4 لتنميتها والسيتوكينات المستجيب، بما في ذلك IL-4 و IL-5، وIL-13، هي مهمة للقيادة استجابات الخلايا B وهي المسببة للأمراض في الحساسية 8، 9. وعلى غرار TH1 الخلايا، تم العثور على خلايا TH2 للتعبير عن نفسه منظم النسخي سيدهم، ووصف GATA-3 10،11. ومن المثير للاهتمام، فإن وجود السيتوكينات استقطاب وتوليد نسب ث المحددة هي معادية لتطوير الآخرين 2،12، مما يوحي بأن مجموعة فرعية فقط ث معينة قد تصبح المهيمنة خلال إعادة المناعياستجابته.
منذ التعرف على Th1 و TH2 الأنساب، وقد أثبت المزيد من العمل حتى أكثر فريدة من نوعها مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة، بما في ذلك مسامي المساعد (TFH)، IL-9-إنتاج (Th9)، وIL-22-إنتاج (Th22) (مؤخرا استعراضها في 13). لأغراض التجارب في المختبر التمايز، وهذا البروتوكول تركز فقط على اثنين من مجموعات فرعية ث إضافية، ووصف خلايا T التنظيمية (Treg) وIL-17-إنتاج خلايا CD4 + T (Th17). CD25 + خلايا T التنظيمية يمكن أن يحدث بشكل طبيعي (nTreg) في الغدة الصعترية. ويمكن أيضا أن يتسبب خلايا ث ساذجة (iTreg) لتصبح التنظيمية في محيط (استعراضها في 14،15). كلا النوعين من Tregs تعبر عن عامل النسخ مميزة، يطلق مربع forkhead P3 (Foxp3)، وهو أمر حاسم لآليات قمع المستجيب لها والتي تشمل إنتاج قابل للذوبان المضادة للالتهابات الوسيط، IL-2 الاستهلاك، وآليات الخلية التي تعتمد على الاتصال 14،15. عدم وجود Foxp3 النتائج في التعبير الشديد، الأعضاء المتعددة اضطراب المناعة الذاتية وصفته ديسريغولاتيون المناعي، polyendocrinopathy، الأمعاء، ومتلازمة X-مرتبط (IPEX)، مما يدل على الدور الحاسم لهذا فرعية ث في حل التهاب وتنظيم التسامح الطرفية في تقرير المصير مستضدات 16. في المختبر، الخلايا المساعدة CD4 + T ساذجة يصل تنظيم Foxp3 وأصبح ملتزما برنامج Treg على التحفيز مع IL-2 و TGF-β 14،15. قد يكون هناك معتدلة إلى اللدونة كبيرة في CD4 + T الأنساب الخلية، وخاصة عند النظر في إنتاج السيتوكينات الوحيد (استعراضها في 17،18). ومع ذلك، لأغراض في المختبر بروتوكولات التمايز، وسوف نناقش كل مجموعة فرعية كما نسب فريدة من نوعها.
مؤخرا، تم تحديد مجموعة فرعية من خلايا Th17 التي تنتج خلوى IL-17 كما نسب فريدة من نوعها مع وظائف الموالية للالتهابات التي هي المسببة للأمراض وخاصة أثناء التهاب المناعة الذاتية 19-21. خلايا Th17 تعبر عن عامل النسخ فريدة من نوعها، ووصف المتعلقة ريتينويد اليتيم مستقبلات غاما ر (RORγt) التي تنسق برنامج جيني Th17 22. TGFβ المهم لتوليد Th17 النسب من خلال تحريض RORγt. ومع ذلك، يعتقد أن تأثير TGFβ إشارات للحث على الالتزام فقط Th17 على التآزر مع IL-6 (استعراضها في 12). وقد أظهرت دراسات أخرى أن مجموعة متنوعة من الإشارات الأخرى التي يمكن أن تنظم بشكل إيجابي التزام Th17، بما في ذلك IL-1β، وزيادة الصوديوم، وTLR اشارة 23-26. وأشارت تقارير أخرى إلى أن خلايا Th17 المسببة للأمراض في الجسم الحي هي تلك التي تجاوز الواقع TGFβ الإشارات وبدلا من ذلك تعتمد على مزيج من IL-1، IL-6، وIL-23 للتمايز على 27. وبالتالي، قد تكون مشتقة خلايا Th17 من مجموعة متنوعة من مسارات الإشارات. لأغراض هذا البروتوكول، وشائعة الاستخدام (TGFβ وIL-6) مسارا لTh17 التزام النسبوستعرض.
البروتوكولات التمايز هو موضح أدناه لجميع الأنساب المستجيب تعتمد على الأجسام المضادة ثابت كما المحفزات لTCR وCD28 في جميع أنحاء كامل التجربة. ومع ذلك، فقد أظهرت آخرون أن تفعيل TCR مع الخلايا العارضة للمستضد 28 أو مكافحة CD3 وأضداد CD28 مع الهامستر الأجسام المضادة ربط عبر لمدة 2 أيام 29 هي أيضا وسيلة فعالة للغاية من تحريض جيل من مختلف مجموعات فرعية ث. بروتوكول المعروضة هنا يبني على أساليب ذكرت سابقا لعزل خلايا CD4 + T الفئران من الأجهزة اللمفاوية الثانوية 30 و توليد خلايا Th17 31. احد الفرق الرئيسي هو أن هذا البروتوكول يعتمد على استخدام فارز خلية لعزل خلايا CD4 + T ساذجة من الأنسجة اللمفاوية. ومع ذلك، العديد من الشركات تقدم الآن مجموعات فصل السريعة التي يمكن أن تثري للخلايا CD4 + T السذاجة، والتي قد تكون قادرة على تجاوز شرط وأو الفرز اعتمادا على التجربة. الطرق والكواشف الواردة في هذا البروتوكول هي التي نستخدمها بشكل روتيني وتجد أن تكون الأكثر فعالية. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن الكواشف ومنهجيات بديلة موجودة لكثير من الخطوات الواردة أدناه، والأمر متروك إلى المختبر الفردية لتحديد ما سوف تعمل بشكل أفضل لتحقيق أغراضهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن الطحال يحتوي على خلايا ث الساذجة، فإن نسبة هذه الفئة من السكان في الغدد الليمفاوية هو أعلى من ذلك بكثير. والفشل في تحديد بشكل صحيح وإزالة العقد اللمفاوية في هذا البروتوكول يؤدي إلى العائد الضعيف للخلايا ساذجة. وهذا يمكن أن يكون من الصعب وخصوصا في الفئران الأ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء المختبر رينولدز في روزاليند فرانكلين جامعة الطب والعلوم، والمختبر تشن دونغ في جامعة تكساس مركز أندرسون للسرطان لتعظيم الاستفادة من هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من خلال منحة لJMR من المعاهد الوطنية للصحة (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
