Mus Naïve CD4<sup> +</sup> T Cell Isolation og<em> In vitro</em> Differentiering til T-celledelmængder
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
Begrebet forskellige afstamninger eller delmængder af CD4 + T-hjælper (Th) celler har eksisteret siden den sidste del af det 20. århundrede 1. Anerkendelse af sammenhørende antigen i nærvær af costimulerende signaler resulterer i flere runder af cellulær proliferation og den endelige differentiering til effektor Th celler. Den type Th-celle dannet under denne proces er afhængig af cytokin miljø stede under aktivering 2. Oprindeligt blev naive Th-celler menes at polarisere i 2 særskilte slægter efter T-celle receptor (TCR) aktivering, samstimulerende CD28-ligering, og cytokin signalering. Type 1-hjælperceller (Th1) er kendetegnet ved deres effektor produktion af IFNy cytokin samt deres krav om IL-12-signalering under differentieringsprocessen 3,4. Til sidst blev det opdaget, at differentierede Th1-celler har en genetisk profil, der er mest markant karakteriseret By ekspressionen af T box familien transskriptionsfaktor Tbx21 (T-bet), der anses for master regulator af Th1 genetiske program 5. Endvidere kan IL-12 samt IFNy fremme T-bet-ekspression 6,7. I immunresponset, Th1-celler er vigtig for værtsforsvar mod intracellulære patogener samt stærke promotorer af autoimmun inflammation. I modsætning, type 2-hjælperceller (Th2) kræver IL-4 for deres udvikling og effektor cytokiner, herunder IL-4, IL-5 og IL-13, er vigtige for at drive B-celle responser og er patogene i allergi 8, 9. Svarende til Th1-celler blev Th2-celler sig at udtrykke deres egen herre transkriptionel regulator, betegnet GATA-3 10,11. Interessant tilstedeværelsen af polariserende cytokiner og frembringelsen af en specifik Th afstamning er antagonistisk til udviklingen af andre 2,12, hvilket tyder på, at kun en bestemt Th delmængde kan blive dominerende i en immun respons.
Da identifikation af Th1- og Th2-slægter er yderligere arbejde vist, endnu mere unikt undergrupper af T-hjælperceller, herunder follikulær hjælper (TFH), IL-9-producerende (Th9) og IL-22-producerende (Th22) (for nylig revideret i 13). Med henblik på in vitro-differentiering eksperimenter vil denne protokol kun fokusere på yderligere to Th delmængder, betegnet regulatoriske T-celler (Treg) og IL-17-producerende CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriske T-celler kan forekomme naturligt (nTreg) i thymus; naive Th celler kan også induceres (iTreg) bliver regulerende i periferien (revideret i 14,15). Begge typer af tregs udtrykker en karakteristisk transskriptionsfaktor, betegnet forkhead box P3 (Foxp3), hvilket er kritisk for deres effektor suppression mekanismer, der indbefatter opløselige anti-inflammatorisk mediator produktion, IL-2 forbrug, og celle-kontakt-afhængige mekanismer 14,15. Manglen på Foxp3 ekspression resulterer i en alvorlig, multi-orgel autoimmun sygdom betegnes immundysreguleringssygdom, polyendocrinopathy, enteropati, X-bundet syndrom (IPEX), hvilket viser den kritiske rolle i denne Th undergruppe i løsningen inflammation og regulere perifer tolerance over selvantigener 16. In vitro, naive CD4 + T-hjælperceller opregulere Foxp3 og blive engageret i Treg program ved stimulering med IL-2 og TGF-β 14,15. Der kan være moderat til betydelig plasticitet i CD4 + T-celle slægter, især når man tænker kun cytokinproduktion (revideret i 17,18). Men med henblik på in vitro-differentiering protokoller, vi skal drøfte hver delmængde som en unik afstamning.
For nylig blev en delmængde af Th17 celler, der producerer IL-17 cytokin identificeret som en unik afstamning med pro-inflammatoriske funktioner, der er særligt patogen under autoimmun inflammation 19-21. Th17 celler udtrykker en unik transkriptionsfaktor, betegnes retinoid-relaterede orphan receptor gamma t (RORγt), der koordinerer Th17 genetiske program 22. TGFp er vigtigt for dannelsen af Th17 afstamning gennem induktion af RORγt. Imidlertid er virkningen af TGF signalering menes at kun fremkalde Th17 engagement ved synergizing med IL-6 (revideret i 12). Yderligere undersøgelser har vist, at en række andre signaler, kan positivt regulerer Th17 engagement, herunder IL-1β, øget natrium og TLR signalering 23-26. Andre rapporter har antydet, at de patogene Th17 celler in vivo er dem, der faktisk omgår TGFp signalering og i stedet stole på en kombination af IL-1, IL-6 og IL-23 for deres differentiering 27. Således kan Th17 celler afledes fra en række signalveje; med henblik på denne protokol, den almindeligt anvendte (TGFp og IL-6) vej for Th17 linjeforpligtelsevil blive præsenteret.
Differentieringen protokoller beskrevet nedenfor for alle effektor slægter afhængig fast antistof som stimuli for TCR og CD28 i hele løbet af forsøget. Imidlertid har andre vist, at TCR-aktivering med antigen-præsenterende celler 28 eller tværbinding anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer med hamster-antistof i 2 dage 29 er også yderst effektivt middel til at inducere frembringelsen af forskellige Th undergrupper. Protokollen præsenteres her bygger på tidligere rapporterede metoder til isolering murine CD4 + T-celler fra sekundære lymfoide organer 30 og generere Th17 celler 31. En væsentlig forskel er, at denne protokol bygger på anvendelsen af en cellesorterer at isolere naive CD4 + T-celler fra lymfoide væv. Men mange virksomheder tilbyder nu hurtig separation kits, der kan berige for naive CD4 + -T-celler, som kan være i stand til at omgå kravet feller sortering afhængig af eksperimentet. De metoder og reagenser, der præsenteres i denne protokol er, hvad vi rutinemæssigt bruge og finde på at være den mest effektive. Men husk på, at alternative reagenser og metoder findes for mange af de skridt, der præsenteres nedenfor, og det er op til den enkelte laboratorium at afgøre, hvad der fungerer bedst for deres formål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens milten indeholder naive Th-celler, andelen af denne population i lymfeknuder er meget højere. Manglende korrekt identificere og fjerne lymfeknuder i denne protokol, vil resultere i en dårlig udbytte af naive celler. Dette kan især være vanskeligt i ældre mus eller hanmus, der har mere fedtvæv. Som vist i figur 1, ordentlig fastgørelse og pinning af animalske lemmer og hud vil give mulighed for lettere visualisering af tilgængelige ydre lymfeknuder. Når lymfeknuder og milt behandles, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Reynolds lab på Rosalind Franklin University of Medicine and Science samt Chen Dong lab ved University of Texas MD Anderson Cancer Center for optimering af denne protokol. Dette arbejde blev støttet af en bevilling til JMR fra National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
