Souris Naïf CD4<sup> +</sup> Isolement des cellules T et<em> In vitro</em> Différenciation en sous-ensembles de cellules T
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 + T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 e siècle 1. Reconnaissance de l'antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l'environnement de cytokines présentes lors de l'activation 2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TCR) d'activation, co-stimulation CD28 ligation et la signalisation des cytokines. 1 des cellules auxiliaires de type Th1 () sont caractérisées par leur production de la cytokine effectrice IFNy ainsi que leur exigence pour l'IL-12 au cours de la signalisation de 3,4 processus de différenciation. Finalement, il a été découvert que les cellules Th1 différenciées ont un profil génétique qui se caractérise plus distinctement by l'expression de la boîte de T facteur de transcription de la famille, Tbx21 (T-bet), qui est considéré comme le régulateur maître du programme génétique Th1 5. En outre, l'IL-12 ainsi que IFN peut favoriser l'expression T-bet 6,7. Dans la réponse immunitaire, les cellules Th1 sont importants pour la défense de l'hôte contre les pathogènes intracellulaires ainsi que des promoteurs forts de l'inflammation auto-immune. En revanche, les cellules de type 2 auxiliaires (Th2) nécessitent l'IL-4 pour leur développement et leur cytokines effectrices, y compris l'IL-4, IL-5 et IL-13, sont importantes pour entraîner des réponses de lymphocytes B et sont pathogènes dans l'allergie 8, 9. Semblables à des cellules Th1, Th2 ont été trouvés pour exprimer leur propre régulateur maître de transcription, appelé GATA-3 10,11. Fait intéressant, la présence de cytokines polarisantes et la génération d'une lignée Th spécifique sont antagonistes à l'élaboration d'autres 2,12, ce qui suggère que seul un sous-ensemble particulier Th peut devenir dominante au cours d'une re immunitaireréponse.
Depuis l'identification des lignées Th1 et Th2, d'autres travaux ont démontré sous-ensembles encore plus unique de cellules T auxiliaires, y compris folliculaire aide (TFH), IL-9-production (Th9), et IL-22-production (TH22) (récemment en revue dans 13). Aux fins d'expériences in vitro de différenciation, ce protocole se concentrer uniquement sur deux sous-ensembles Th supplémentaires, appelés cellules T régulatrices (Treg) et les cellules T CD4 + IL-17-production (Th17). cellules T régulatrices CD25 + peuvent se produire naturellement (nTreg) dans le thymus; cellules Th naïves peuvent également être induites (iTreg) pour devenir réglementaire dans la périphérie (revue dans 14,15). Les deux types de Tregs expriment un facteur de transcription caractéristique, appelé boîte forkhead P3 (Foxp3), ce qui est essentiel pour leurs mécanismes de suppression effectrices qui incluent la production soluble anti-inflammatoire médiateur, IL-2 la consommation, et la cellule mécanismes de contact dépendant 14,15. Le manque de Foxp3 résultats d'expression dans un grave, plusieurs organes trouble auto-immune appelés dysrégulation immunitaire, polyendocrinopathie, entéropathie, le syndrome lié à l'X (IPEX), démontrant le rôle critique de ce sous-ensemble Th dans la résolution de l'inflammation et de réglementer la tolérance périphérique aux antigènes du soi 16. In vitro, les cellules T helper CD4 + naïfs jusqu'à régulent Foxp3 et adhérer au programme Treg lors de la stimulation par l'IL-2 et TGF-β 14,15. Il peut être modérée à la plasticité considérable lignées de cellules T CD4 +, en particulier lorsque l'on considère que la production de cytokines (revue dans 17,18). Toutefois, pour les fins de protocoles in vitro de différenciation, nous allons discuter chaque sous-ensemble comme une lignée unique.
Récemment, un sous-ensemble de cellules Th17 qui produit la cytokine IL-17 a été identifié comme une lignée unique avec des fonctions pro-inflammatoires qui sont particulièrement pathogène pendant une inflammation auto-immune 19-21. Th17 cellules expriment un facteur de transcription unique appelé liés rétinoïde-récepteur orphelin gamma t (RORγt) qui coordonne le programme génétique 22 Th17. TGFß est important pour la génération de la lignée Th17 par l'induction de RORγt. Cependant, on croit l'effet de la signalisation TGF pour induire seul engagement sur Th17 synergie avec l'IL-6 (revue dans 12). D'autres études ont montré qu'une variété d'autres signaux qui peuvent réguler positivement l'engagement Th17, y compris l'IL-1β, l'augmentation de sodium et de signalisation TLR 23-26. D'autres rapports ont suggéré que les cellules Th17 pathogènes in vivo sont ceux qui contournent effectivement signalisation TGFß et se appuient sur une combinaison de IL-1, IL-6, IL-23 et de 27 leur différenciation. Ainsi, les cellules Th17 peuvent être dérivées d'une variété de voies de signalisation; aux fins de ce protocole, l'couramment utilisé (TGFß et de l'IL-6) voie d'un engagement de la lignée Th17sera présenté.
Les protocoles décrits ci-dessous de différenciation pour toutes les lignées effectrices repose sur l'anticorps fixe comme stimuli pour le TCR et CD28 pendant toute la durée de l'expérience. Cependant, d'autres ont démontré que l'activation du TCR avec des cellules présentatrices d'antigène 28 ou de reticulation anti-CD3 et anti-CD28 avec un anticorps de hamster pendant 2 jours 29 sont également des moyens très efficaces pour induire la production de divers sous-ensembles Th. Le protocole présenté ici se appuie sur les méthodes précédemment rapportées pour isoler des cellules T CD4 + murines des organes lymphoïdes secondaires 30 et générer des cellules Th17 31. Une différence majeure est que ce protocole repose sur l'utilisation d'un trieur de cellules pour isoler les cellules T CD4 + naïfs provenant de tissus lymphoïdes. Cependant, de nombreuses entreprises offrent maintenant des kits de séparation rapides qui peuvent enrichir des cellules naïves T CD4 +, qui peuvent être en mesure de contourner l'exigence fou le tri en fonction de l'expérience. Les méthodes et les réactifs présentés dans ce protocole sont ce que nous utilisons régulièrement et de trouver pour être le plus efficace. Cependant, gardez à l'esprit que les réactifs et les méthodes alternatives existent pour la plupart des étapes présentées ci-dessous et ce est au laboratoire individu de déterminer ce qui fonctionnera le mieux pour leurs fins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que la rate contient des cellules Th naïves, la proportion de cette population dans les ganglions lymphatiques est beaucoup plus élevé. L'incapacité d'identifier correctement et enlever les ganglions lymphatiques dans ce protocole se traduira par un mauvais rendement des cellules naïves. Cela peut être particulièrement difficile dans les souris des souris mâles âgés ou qui ont plus de tissus gras. Comme le montre la figure 1, une fixation correcte et piégeage des membres et de la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Reynolds au Rosalind Franklin Université de médecine et des sciences, et le laboratoire Chen Dong à l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center pour l'optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de JMR de la National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
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