Maus Naive CD4<sup> +</sup> T-Zell-Isolierung und<em> In-vitro-</em> Differenzierung in T-Zell-Populationen
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin-Signalisierung zu polarisieren. Typ-1-Helfer-Zellen (Th1) mit ihren Effektorfunktionen Produktion des IFN Cytokin sowie deren Erfordernis für IL-12-Signalisierung während des Differenzierungsprozesses 3,4 gekennzeichnet. Schließlich wurde entdeckt, dass differenzierte Th1-Zellen eine genetische Profil, das am meisten ausgeprägt auszeichnet b habeny der Ausdruck der T-Box-Familie Transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), die als die Hauptregulator des Th1 genetische Programm 5 ist. Darüber hinaus kann IL-12 sowie IFNy T-bet Ausdruck 6,7 fördern. In der Immunantwort sind Th1-Zellen wichtig für die Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Pathogene sowie starke Promotoren von Autoimmunentzündung. Demgegenüber Typ 2-Helfer-Zellen (Th2) erfordern IL-4 für ihre Entwicklung und ihre Effektorfunktion Cytokine, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13, sind für den Antrieb B-Zell-Antworten und sind pathogen Allergie 8, 9. Ähnlich wie Th1-Zellen wurden Th2-Zellen gefunden, um ihre eigenen Master Transkriptionsregulator zum Ausdruck, bezeichnet GATA-3 10,11. Interessanterweise ist das Vorhandensein von polarisierenden Cytokine und die Erzeugung eines spezifischen Th Linie antagonistisch auf die Entwicklung anderer 2,12, was darauf hindeutet, daß nur eine bestimmte Teilmenge Th kann während einer Immunwieder dominantAntwort.
Da die Identifizierung der Th1 und Th2-Linien hat weitere Arbeit noch einzigartig Gruppen von T-Helfer-Zellen, einschließlich follikulären helper (TFH), IL-9-produzierenden (Th9) und IL-22-produzierenden (Th22) (kürzlich gezeigt in 13 überprüft). Für die Zwecke der in vitro Differenzierungsexperimente wird dieses Protokoll nur an zwei weiteren Th Subsets konzentrieren, genannt regulatorischen T-Zellen (Treg) und IL-17-produzierenden CD4 + T-Zellen (Th17). CD25 + regulatorische T-Zellen können natürlich (nTreg) im Thymus auftreten; naiven Th-Zellen können auch induziert werden (iTreg) Regulierungs in der Peripherie (in 14,15 prüft) zu werden. Beide Arten von Treg exprimieren eine charakteristische Transkriptionsfaktor, bezeichnet als forkhead Feld P3 (Foxp3), die kritisch für ihre Effektorfunktion Unterdrückungsmechanismen, die lösliche entzündungshemmende Mediatorproduktion, IL-2 -Verbrauch und Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen 14,15 enthalten ist. Das Fehlen Foxp3-Expression führt zu einer schweren, Multiorgan-Autoimmunerkrankung bezeichnet Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-chromosomale Syndrom (IPEX), was die wichtige Rolle dieses Th Teilmenge der Lösung Entzündung und Regel periphere Toleranz gegen Selbst-Antigene 16. In vitro, naive CD4 + T-Helfer-Zellen hochreguliert Foxp3 und sich verpflichtet, die Treg-Programm nach der Stimulation mit IL-2 und TGF-β 14,15. Es kann mäßige bis erhebliche Plastizität in CD4 + T-Zelllinien, vor allem, wenn man bedenkt, nur Zytokin-Produktion (in 17,18 prüft). Jedoch für die Zwecke der in vitro Differenzierungsprotokollen, werden wir uns mit jeder Untermenge als einmalige Linie.
Vor kurzem wurde eine Teilmenge von Th17 Zellen, die den IL-17-Zytokin produziert als einmalige Linie mit proinflammatorischen Funktionen, die während Autoimmunentzündung 19-21 besonders pathogene identifizierten. Th17-Zellen exprimieren eine einzigartige Transkriptionsfaktor, genannt Retinoid bezogenen Orphan-Rezeptor gamma t (RORγt), die die Th17 genetische Programm 22 koordiniert. TGF & bgr; ist durch die Induktion RORγt wichtig für die Erzeugung von Th17 Linie. Allerdings ist die Wirkung von TGF & beta Signalisierungs Vermutlich nur veran Th17 Verpflichtung auf synergizing mit IL-6 (in 12 überprüft). Weitere Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen Signalen, die positiv regulieren Th17 Vereinbarung, einschließlich IL-1β, erhöhte Natrium und TLR 23-26. Andere Berichte haben vorgeschlagen, daß die pathogenen Th17 Zellen in vivo sind diejenigen, die tatsächlich zu umgehen TGFß Signalisierung und sich stattdessen auf eine Kombination von IL-1, IL-6 und IL-23 für ihre Differenzierung 27 verlassen. Somit kann Th17 Zellen aus einer Vielzahl von Signalwegen abgeleitet werden; für die Zwecke dieses Protokolls, die gemeinsam verwendete (TGFß und IL-6) Weg für Th17 Linienfestlegungvorgestellt.
Die im folgenden für alle Effektor Linien beschriebenen Differenzierungsprotokollen beruht auf fixierten Antikörper als Stimuli für die TCR und CD28 über den gesamten Verlauf des Experiments. Allerdings haben andere gezeigt, dass TCR-Aktivierung mit Antigen-präsentierenden Zellen 28 oder vernetzendem Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper mit Hamster-Antikörper für 2 Tage 29 sind auch sehr wirksames Mittel zur Induktion der Erzeugung von verschiedenen Th Teilmengen. Die hier vorgestellte Protokoll baut auf die zuvor berichtete Verfahren zur Isolierung von murinen CD4 + T-Zellen von sekundären lymphatischen Organe 30 und erzeugen Th17 Zellen 31. Ein wichtiger Unterschied ist, dass dieses Protokoll beruht auf der Verwendung eines Zellsortierers, naive CD4 + T-Zellen aus lymphoiden Geweben zu isolieren. Viele Firmen bieten inzwischen schnelle Trennung Kits, die für naive CD4 + T-Zellen anreichern können, die vielleicht die Voraussetzungen f umgehen sein könnenoder Sortier je nach Experiment. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll vorgestellt werden sind, was wir routinemäßig und zu finden, um die effektivste. Aber bedenken Sie, dass alternative Reagenzien und Methoden für viele der Schritte im folgenden dargestellt existieren und es ist bis zu den einzelnen Labor, um festzustellen, was am besten für ihre Zwecke zu arbeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zug?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
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