Mus Naiv CD4<sup> +</sup> T Cell Isolering och<em> In vitro</em> Differentiering i T cellundergrupper
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
Begreppet distinkta linjer eller undergrupper av CD4 + T-hjälpar (Th) celler har funnits sedan slutet av 20-talet 1. Erkännande av besläktade antigen i närvaro av samstimulerande signaler resulterar i flera omgångar av cellulär proliferation och den slutligen differentiering till effektor Th-celler. Den typ av Th-celler som genereras under denna process är beroende av cytokin miljön närvarande under aktivering 2. Inledningsvis var naiva Th-celler tänkt att polarisera i 2 distinkta linjer efter T-cellsreceptor (TCR) aktivering, samstimulatorisk CD28 tion, och cytokin signalering. Typ 1-hjälparceller (Th1) kännetecknas av sin effektor produktionen av IFNy-cytokin samt deras krav för IL-12-signalering under differentieringsprocessen 3,4. Så småningom upptäcktes att differentierade Th1 celler har en genetisk profil som är mest tydligt präglas by expressionen av T behållaren familj transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), som anses vara huvudregulator av Th1 genetiska program 5. Vidare kan IL-12 samt IFNy främja T-bet uttryck 6,7. I immunsvaret, Th1-celler är viktiga för värd försvar mot intracellulära patogener samt starka främjare av autoimmun inflammation. I kontrast, typ 2 hjälparceller (Th2) kräver IL-4 för sin utveckling och deras effektorfunktioner cytokiner, innefattande IL-4, IL-5 och IL-13, är viktiga för att driva B-cellsvar och är patogena i allergi 8, 9. Liknar Th1-celler, Th2 celler fann att uttrycka sin egen herre transkriptionsregulator, benämnd GATA-3 10,11. Intressant, närvaron av polariserande cytokiner och generering av en specifik Th härstamning är antagonistiska till utvecklingen av andras 2,12, vilket tyder på att endast en viss Th delmängd kan bli dominerande under en immun reResponse.
Eftersom identifieringen av Th1 och Th2 härstamningar, har ytterligare arbete visat ännu mer unika delmängder av T-hjälparceller, däribland follikulär hjälpare (TFH), IL-9-producerande (Th9), och IL-22-producerande (Th22) (nyligen ses över 13). Vid tillämpning av in vitro-differentieringsexperiment kommer detta protokoll att fokusera ytterligare endast på två Th delmängder, benämnda regulatoriska T-celler (Treg) och IL-17-producerande CD4 + T-celler (Th17). CD25 + regulatoriska T-celler kan förekomma naturligt (nTreg) i tymus; naiva Th-celler kan också induceras (iTreg) att bli reglerings i periferin (översikt i 14,15). Båda typerna av tregs uttrycka en karakteristisk transkriptionsfaktor, benämnd forkhead låda P3 (Foxp3), vilket är avgörande för att de effektor undertryckande mekanismer som inkluderar lösliga antiinflammatorisk mediator produktion, IL-2 konsumtion, och cellkontaktberoende mekanismer 14,15. Bristen på Foxp3 uttryck resulterar i en allvarlig, multi-organ autoimmun sjukdom kallas immun dysreglering, polyendocrinopathy, enteropathy, X-bunden syndrom (IPEX), visar den kritiska roll denna Th delmängd lösa inflammation och reglera perifer tolerans mot självantigener 16. In vitro, naiva CD4 + T-hjälparceller uppreglera Foxp3 och bli engagerad i Treg-programmet vid stimulering med IL-2 och TGF-β 14,15. Det kan vara måttlig till stor plasticitet i CD4 + T-cellinjer, speciellt när man överväger endast cytokinproduktion (ses över 17,18). Men i samband med in vitro differentiering protokoll, vi kommer att diskutera varje delmängd som en unik härstamning.
Nyligen genomfördes en delmängd av Th17 celler som producerar IL-17 cytokin identifierats som en unik härstamning med proinflammatoriska funktioner som är särskilt patogena under autoimmun inflammation 19-21. Th17 celler uttrycker en unik transkriptionsfaktor, benämnd retinoid relaterade föräldralös receptor gamma t (RORγt) som samordnar Th17 genetiska programmet 22. TGFp är viktigt för generering av Th17 härstamning genom induktion av RORγt. Emellertid är effekten av TGFp-signalering tros endast inducera Th17 åtagande vid synergizing med IL-6 (översikt i 12). Ytterligare studier har visat att en rad andra signaler som positivt kan reglera Th17 engagemang, inklusive IL-1β, ökad natrium- och TLR signalering 23-26. Andra rapporter har antytt att de patogena Th17 celler in vivo är de som faktiskt kringgår TGPP signalering och istället förlita sig på en kombination av IL-1, IL-6 och IL-23 för deras differentiering 27. Sålunda kan Th17 celler härledas från en mängd olika signalvägar; vid tillämpningen av detta protokoll, den vanligt förekommande (TGF och IL-6) väg för Th17 härstamning engagemangkommer att presenteras.
De differentierings protokoll som beskrivs nedan för alla effektor härstamningar bygger på fasta antikropp som stimuli för TCR och CD28 under hela loppet av experimentet. Men andra har visat att TCR aktivering med antigenpresenterande celler 28 eller tvärbindning anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar med hamster antikropp för 2 dagar 29 är också mycket effektivt medel för att inducera generering av olika Th delmängder. Protokollet presenteras här bygger på tidigare rapporterade metoder för att isolera murina CD4 + T-celler från sekundära lymfoida organ 30 och generera Th17 celler 31. En stor skillnad är att detta protokoll förlitar sig på användning av en cellsorterare för att isolera naiva CD4 + T-celler från lymfoid vävnad. Men många företag erbjuder nu snabba separations kit som kan berika för naiva CD4 + T-celler, vilket kanske kan kringgå kravet feller sorterings beroende på experimentet. De metoder och reagens som presenteras i detta protokoll är det vi använder rutinmässigt och finna att vara den mest effektiva. Men tänk på att alternativa reagens och metoder finns för många av de steg som presenteras nedan och det är upp till den enskilda labbet för att avgöra vad som fungerar bäst för sina syften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan mjälten innehåller naiva Th-celler, är den andel av denna population i lymfkörtlar mycket högre. Underlåtenhet att korrekt identifiera och avlägsna lymfkörtlar i detta protokoll kommer att resultera i en dåligt utbyte av naiva celler. Detta kan vara särskilt svårt i äldre möss eller hanmöss som har mer fettvävnad. Såsom visas i fig 1, fastsättning och nålning av de djur lemmar och huden kommer att möjliggöra enklare visualisering av de åtkomliga yttre lymfkörtlar. När lymfk?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla medlemmar i Reynolds labbet vid Rosalind Franklin University of Medicine and Science, och Chen Dong labbet vid University of Texas MD Anderson Cancer Center för optimering av detta protokoll. Detta arbete stöddes av ett bidrag till JMR från National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
Referências
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
- Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
- Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
- Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
- Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
- Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
- Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
- Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
- Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
- Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
- Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
- Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
- Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
- Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
- Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
- Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
- Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
- Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
- Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
- Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
- Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
- Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
- Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
