Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıkların kaynaklanan kusurlar Lokomotif subklinik dejenerasyon yıl sonra, hastalığın geç başlangıçlı belirtisi olabilir ve böylece güncel tedavi tedavi stratejileri küratif değildir. Bütün exome sekanslama kullanımı sayesinde, genlerin artan sayıda insan hareket bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu genlerin tanımlanması rağmen, bu genler, normal lokomotif işleyişi için çok önemlidir kadar bilinmemektedir. Bu nedenle, tedavi edici ilgi yeni hedefler belirlemek için bu genlerin rolünü aydınlatmak için model organizmalar kullanan güvenilir bir tahlil, her zamankinden daha fazla ihtiyaç vardır. Biz daha önce hafif kusurların tespiti için izin verir ve zamanla bu hataları değerlendirmek için yeteneğine sahiptir negatif geotaxis testin bir hassaslaşmış versiyonunu tasarladık. Bir bardak gerçekleştirilir tahlil bir mum bariyer film ile kapatılır silindir, mezun oldu. Eşik mesafesi arttırarak 17.5 c tırmandı içinm biz hafif hareketlilik bozuklukları tespit daha büyük bir duyarlılık gözlemledik 2 dk deneme süresinin artırılması ve. Tahlil maliyetli ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Bu hareket kusurları ile Drosophila mutantlar aday ilaçların taranması için mükemmel bir tekniktir yapar.
Introduction
Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, kalıtımsal spastik parapleji yıkıcı nörodejeneratif bozukluklar giderek daha kabul edilmektedir. Ne yazık ki, bu nörodejeneratif bozuklukların en işlemler olmaksızın halen devam etmektedir. Bu tür genlerin artan sayıda yol açmıştır bütün exome sıralama olarak genom, tarafsız genetik testlerin yaygın klinik kullanımı, insan lokomotif bozukluklar karışması. Bu ilerlemeye rağmen, erken ve geç aşamalarında patolojik ilerleme, bu hastalıklarda zor kalır. Drosophila kontrollü mekansal ve zamansal bir şekilde gen gereksinimi eğitimi için genetik araçları ile tek sağlar. Buna ek olarak, Drosophila gibi Parkinson 1, Alzheimer 2, zihinsel engelli 3,4 ve diğerleri arasında epilepsi 5,6 gibi nörolojik durumlar için ilaç tarama yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Amacımız etkili bir maliyet geliştirmektive güvenilir tahlil hala motorun performansında küçük değişiklikleri tespit etmek yeterli duyarlı olacağını yüksek verimli analizi izin verecek.
Drosophila tırmanma davranışı üzerinde genetik mutasyon ve / veya çevresel durumun etkisini ölçmek için kullanılan çeşitli tahliller vardır. Tahlillerin çoğu olumsuz geotaxis veya tırmanma deneyi olarak bilinen tırmanmaya sinekler, doğal eğilim yararlanmak. Benzer 7 phototaxis çalışma için kullanılan karşı akım cihazı ayrıca gravitaxis incelemek için kullanılabilir ki 1967 önerdi. O günden bu yana, Ganetsky 8 ve diğerleri 9 -12 ilk tahlil üzerine inşa etmişlerdir. prensip şişe içinde sinekler bilinen bir dizi yerleştirin ve sinekler şişenin dibine düşmeye neden sert bir yüzeye şiddetle karşı flakon dokunun etmektir. Bu doğuştan gelen bir davranış olduğundan, sinekler yerçekimine karşı flakon üst tırmanmaya çalışacaktır. Bu deney, nicel ve measu olankaç sinekler res bir ayrılan süre içinde flakon üzerinde bir işaretleyici geçmiş tırmandı. Hız yerine sinekler tırmanma toplam sayısının ölçülmesi güvenilir bir parametre haline ve sinekler kriterlerin sayısı 13 anlamlı değildi durumlarda kusurları göstermiştir.
Tırmanma deney Parkinson hastalığı 14 de dahil olmak üzere pek çok nöro-dejeneratif hastalıkların incelenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, nörodejenerasyon önceden patolojik çalışmalar 14 görülür burada lokomotif bozukluklar zamanda ölçemeyebilirler kaydetti. Böylece, geleneksel testin kullanılması hastalığın patogenezinde erken aşamalarında incelemek için yeteneğini sınırlayabilir. patoloji sonraki aşamalarında lokomotif kusurların görünümünü olan ilerleme tam kurtarılması için çok gelişmiş bir hastalık yansıtabilir.
Bu geleneksel tırmanma testinin duyarlılığı ile potansiyel bir sorun ortaya çıkarmaktadır. gelenek potansiyel yetersizlikHafif lokomotif kusurları tespit etmek için tahlil tırmanma arası sinekler tırmanmaya gerekli olan yüksekliği isnat edilebilir. Geleneksel deneyi 15,16 ölçer sineklerin sayısı başarılı bir şekilde 20 saniye için 10 içinde 2-5 cm'lik bir yüksekliğe tırmanmaya.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila önce Parkinson hastalığı 14 ve diğer nörodejeneratif koşulların 1,2 mükemmel bir modeli olduğu kanıtlanmıştır. Drosophila uygun genetik araçlar ek olarak, kendi genomu yüksek nörolojik bozuklukların 19 katılan genler için muhafaza edilir. (Bütün exome sıralama dahil) genom genetik tarama yöntemlerinin gelişi insan hareketi bozuklukları ile ilişkili aday genlerin büyük bir listesini sunmak için devam etmesi muhtemeldir. Bu durumla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer’s disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D’Abrera, H. J. M. . Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).
