Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de Caenorhabditis elegans

Summary

Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

Abstract

O comportamento é controlado pelo sistema nervoso. Imagem de cálcio é um método simples no nematóide Caenorhabditis elegans transparente para medir a actividade dos neurónios durante vários comportamentos. Para correlacionar com actividade neuronal comportamento, o animal não deve ser imobilizada, mas deve ser capaz de se mover. Muitas mudanças comportamentais ocorrem durante escalas de tempo longos e exigem a gravação ao longo de muitas horas de comportamento. Isto também faz com que seja necessário para a cultura os vermes na presença de alimentos. Como vermes podem ser cultivadas e sua atividade neural fotografada em escalas de tempo longos? Agarose MicroChamber Imagem (AMI) foi desenvolvido anteriormente para a cultura e observar pequenas larvas e agora foi adaptado para estudar todas as fases da vida do início L1 até o estágio adulto de C. elegans. AMI pode ser realizada em vários estágios da vida de C. elegans. Imagem de cálcio a longo prazo é conseguido sem imobilizar os animais usando exposições de curta acionadas externamente comcombinada com um elétron multiplicação de carga acoplada gravação dispositivo (EMCCD) câmera. Diminuir o zoom ou a digitalização pode escalar até este método para a imagem até 40 vermes em paralelo. Assim, é descrito um método para o comportamento e actividade neural imagem em escalas de tempo longos em todas as fases da vida de C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans foi estabelecido como um sistema modelo para estudar o comportamento¹. Devido à sua receptividade à genética, os mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao comportamento podem ser estudados. Muitos comportamentos ocorrem em longas escalas de tempo. Duas abordagens principais podem ser usadas para observar animais móveis em longas escalas de tempo. A primeira abordagem é seguir o animal durante o movimento usando um estágio automatizado ou câmera^2-8 e a segunda é restringir o movimento a um alcance que seja pelo menos tão pequeno quanto o campo de visão da câmera^9-14. Ambos os métodos têm suas vantagens. O rastreamento permite seguir um animal em longas distâncias espaciais, mas limita o número de animais que podem ser discernidos em um experimento. Restringir o movimento dos animais permite ampliar a observação para muitos indivíduos ao mesmo tempo, usando matrizes de compartimentos restritos.

Como o nematóide é transparente, a imagem fluorescente ao vivo pode ser realizada de forma não invasiva¹⁵. A imagem de cálcio fornece uma leitura funcional da atividade das células excitáveis e é estabelecida para C. elegans^16-20. O cálcio entra na célula através de canais na membrana plasmática que se abrem após a despolarização. Assim, o cálcio atua como um proxy para a atividade neural. Os sensores de cálcio podem ser agrupados em duas classes principais, sensores raciométricos e não raciométricos. Ambas as classes empregam mudanças conformacionais de proteínas de ligação ao cálcio induzidas pela ligação do cálcio. Os sensores raciométricos contêm duas proteínas fluorescentes. Quando a proteína fluorescente de comprimento de onda mais baixo é excitada, uma parte da energia da luz é transmitida para a proteína fluorescente de comprimento de onda mais alto em função de sua distância em um processo chamado Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência ou Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) ²¹ . Os sensores não raciométricos são baseados em GFP permutada circularmente e empregam a extinção do fluoróforo causada pela ligação do cálcio²². Cada classe tem suas vantagens. Enquanto os sensores raciométricos são menos sensíveis a artefatos de movimento ou expressão, os sensores não raciométricos normalmente têm uma faixa dinâmica mais alta. Sensores raciométricos e não raciométricos têm sido úteis para estudar a atividade de células excitáveis em C. elegans^16-20,23,24.

Ao fazer imagens de fluorescência de longo prazo, o experimentador terá que lidar com vários desafios potenciais: 1. Perturbação do comportamento através da luz de excitação: Os vermes são sensíveis à luz de excitação de fluorescência de comprimento de onda curto e evitam a luz da faixa violeta a azul que é usada para imagens de cálcio^25,26. Os vermes respondem com uma resposta de fuga para trás ou para frente^25,26. Assim, a quantidade de luz precisa ser controlada. 2. Branqueamento da proteína do sensor fluorescente: Muitas vezes, o branqueamento da proteína fluorescente dificulta a imagem a longo prazo. Normalmente, no entanto, as intensidades de luz necessárias para observar o branqueamento são maiores do que as intensidades de luz que causam efeitos perturbadores no comportamento dos animais. Assim, o branqueamento é apenas um problema teórico neste tipo de imagem de cálcio. 3. Os vermes dentro das microcâmaras não são fixos e se movem constantemente durante o comportamento de vigília e as imagens podem parecer borradas se o verme não estiver imobilizado. Todos esses desafios podem ser resolvidos usando tempos de exposição extremamente curtos com baixa intensidade de luz. Isso pode ser realizado usando uma câmera EMCCD altamente sensível com tempos de exposição curtos e acionamento externo de um diodo emissor de luz (LED). Para expor os vermes à luz de iluminação o mais brevemente possível (somente durante o tempo de exposição da câmera), o LED é acionado externamente usando um sinal de lógica transistor-transistor (TTL) que a câmera emite durante a exposição, resultando em uma iluminação do verme precisamente pelo tempo em que o chip da câmera é exposto. Isso também significa que o chip EMCCD ficará escuro durante a leitura de dados, o que é ideal para o desempenho de leitura deste chip.

Anteriormente, microcâmaras de agarose foram desenvolvidas para imagens de fluorescência de longo prazo de larvas de C. elegans ⁹. Aqui, é descrito como as microcâmaras de agarose podem ser usadas para imagens de cálcio de longo prazo para qualquer estágio da vida de C. elegans, como a imagem de cálcio pode ser realizada e como esse método pode ser aprimorado para testar muitos vermes individuais em paralelo.

Protocol

1. Os instrumentos, Meios de Cultura, e pratos

1. Usar um microscópio que é capaz de manter a amostra em foco e que está equipado com uma fase automática. Construir um aquecedor tampa feito por encomenda ou comprar uma solução comercial. Configuro um EMCCD LED sistema de câmera em que a exposição da câmera dispara iluminação LED através de um sinal TTL utilizando as instruções do fabricante.
   Nota: Veja a discussão para mais detalhes.
2. Polydimethylsiloxan (PDMS) selos:
   1. Fabricar PDMS selos em uma instalação de microfluídica ou ter os selos PDMS produzidos por uma fundição comercial. Para usar uma fundição comercial, enviar um arquivo do AutoCAD para a empresa e especificar a profundidade (15 mm, por exemplo) do dispositivo. Após a entrega da fundição, cortar o chip PDMS em seus selos 16 usando um bisturi.
   2. Relacionar cada selo indivíduo para uma lâmina de vidro usando plasma de ar. Para a colagem, expor tanto o selo PDMS ea lâmina de vidro de plasma de ar para umataque 1 min (usando as definições de plasma mais elevados a 0,5 mbar). Certifique-se de que as superfícies de ligação virado para cima durante o tratamento de plasma. Em seguida, coloque o selo PDMS para a lâmina de vidro.
3. Tomar um prato inferior 3,5 cm, e cortar uma área quadrada de 18 x 18 mm a partir do centro do fundo do prato utilizando uma fresadora vertical e lâminas rotativas afiadas. Use baixa velocidade de rotação da ferramenta de corte e de alimentação lenta para evitar que o plástico a partir de derretimento devido ao calor produzido pelo atrito. Prepare vários pratos de uma só vez.
   Nota: O prato inferior pode ser reutilizado muitas vezes depois da experiência, se for feita após imersão em etanol puro S / N.
4. Agarose:
   1. Dissolve-se 3 g de alto ponto de fusão de agarose em 100 ml de S-basal (5,85 g de NaCl, 1 g de K ₂ HPO _4, 6 g _de KH ₂ PO _4, 1 mL de colesterol (5 mg / ml em etanol), H ₂ O para uma L, esterilizar em autoclave) por fervura. Faça alíquotas da dissolvido em 2 ml de agarose a tubos de Eppendorf e store. Além disso, preparar um lote de baixo ponto de fusão de agarose exactamente da mesma maneira que o ponto de agarose-elevado ponto de fusão.
   2. Antes da utilização, colocar três alíquotas de alto ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C. Antes da utilização, colocar uma alíquota de baixo ponto de fusão de agarose para um bloco de aquecimento a 95-98 ° C até se ter fundido e em seguida, para um bloco de aquecimento a 30 - 35 ° C.

2. Seleção de Animais

1. Crescer vermes em uma baixa densidade em placas NGM semeados obter animais limpos. Certifique-se de que há uma abundância de comida e apenas alguns animais sobre a placa.
2. Para imagens de larvas L1, transferir cerca de 30 ovos contendo embriões na fase de pretzel em um prato fresco NGM semeado. Para a transferência de estágios larvais mais tarde ou adulto C. elegans, transferir cerca de 30 vermes em um prato fresco NGM semeado.

3. Preparação de agarose microchambers

1. Preparação da cápsula:
   1. Tomar um prato de plástico com uma abertura quadrada de 18 x 18 mm na parte inferior e colocá-lo de cabeça para baixo, com a abertura virada para cima. Feche a abertura, colocando um pedaço de fita adesiva dupla face de 20 x 20 mm para a abertura. Rodar o prato em torno de modo que a fita adesiva é na parte inferior e colocar o prato sobre uma superfície dura. Corte a abertura livre usando um bisturi.
   2. Usando uma pipeta P1000, encher 2 ml de 3% de ponto de fusão elevado de agarose em S-basal para o prato. Coloque a agarose para a área que circunda a abertura e deixar solidificar. Aguarde até que a agarose é sólido.
   3. Vire-se o prato e retire a película protetora que cobre a fita adesiva dupla face, de modo que o lado adesivo permanecerá no prato e serão expostos.
      Observação: Como resultado, uma fina anel de fita adesiva irá rodear o exterior da abertura. A agarose serve como um reservatório de humidade, que mais tarde irá rodear a amostra.
2. Fundição de microchambers:
   1. Expor the superfície de PDMS para moldar com plasma de ar para 20-60 seg.
      Nota: O tratamento por plasma torna o PDMS superfície hidrofílica, o que evita o aprisionamento de bolhas de ar e produz impressões mais nítidas.
   2. Construir dois espaçadores de altura igual empilhando 5-9 lâminas de vidro. Place, em paralelo com os seus lados compridos, o primeiro espaçador pilha, em seguida, uma única lâmina de vidro, em seguida, novamente uma pilha espaçador. Colocar a lâmina de vidro que contém o selo PDMS ortogonalmente entre os espaçadores. Ajustar a altura dos espaçadores, de modo que existe um espaço de cerca de 1,5 mm entre a superfície de moldagem do selo PDMS e a única lâmina de vidro.
   3. Coloque uma gota de ponto quente agarose de alta fusão líquido sobre a lâmina de vidro única perto do selo PDMS e rapidamente deslizar as PDMS selo verticalmente no agarose líquido. Deixe a agarose solidificar. Verifique se ele ganha uma aparência opaca, o que normalmente leva cerca de 2 min. Retire o selo verticalmente com um movimento.
      Nota: É conveniente glue o espaçador desliza em conjunto com fita adesiva dupla face. O movimento vertical do selo evita bolhas de ar fiquem presas na agarose.
3. Transferir os ovos ou vermes em conjunto com bactérias OP50 para a agarose usando uma picareta fio de platina bem. Distribuir um ovo ou um verme por câmara em conjunto com os alimentos utilizando uma pestana. Encha cerca de 30 ovos sobre uma almofada de agarose.
4. Corte a laje de agarose contendo os microchambers preenchidos em um quadrado de cerca de 15 x 15 mm para que ele se encaixa muito bem na abertura do prato. Pegue o pedaço de agarose quadrado com uma pinça e colocá-lo de cabeça para baixo sobre uma lamela de vidro de 20 x 20 mm. Uma vez que caiu, não levantá-lo novamente ou deslize-o ao redor, porque isso pode fazer com que as bactérias e vermes para ser empurrado para fora de suas câmaras.
5. Assembléia do prato:
   1. Coloque a lamela de vidro para a abertura do prato de plástico. Pressione suavemente a lamela de vidro no anel feito de fita adesiva dupla face.Tome cuidado para não quebrar o vidro.
   2. Rodar o prato de cabeça para baixo e usar uma pipeta P1000 para preencher a lacuna entre a laje de agar contendo as microcâmaras e o reservatório de líquido de agarose com ponto de agarose de baixo ponto de fusão arrefecidos a cerca de 30 ° C. Aguarde até que a agarose solidificou.
   3. Selar o prato com uma tampa. Para microscópios invertidos usar uma tampa aquecida. Para microscópios verticais usar uma tampa normal e selar o prato com Parafilm.
6. Depois de terminar a preparação de microchambers, vê-los sob um microscópio estereoscópico. O preenchimento correto é crucial. Veja a discussão para mais detalhes.

Imagem 4. Cálcio

1. Use linhagens transgênicas expressando sensores de cálcio geneticamente codificados como HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) ^27.
2. Use um microscópio composto equipado para todo o campo de epifluorescência. Ligue a saída TTL da câmera para EMCCDa entrada TTL do LED, de modo que cada vez que a câmera registra uma moldura a amostra será iluminado. Usar um tempo de exposição de cerca de 5 mseg. Use EM ganho na gama de 50-300.
3. Especifique um filme estouro funcionamento durante 24 horas com cada um verme que está sendo exibido a cada 15-30 min primeiro por 20 s com DIC, em seguida, durante 20 segundos com uma fluorescência da GFP para gravar GCaMP, e em seguida, tomar uma imagem final do sinal mKate2 é levado para controlo para níveis de expressão. Use uma taxa de quadros de 2 / seg durante cada explosão.
4. Para a inspeção visual de dados, use um mapa de cores falsas para aumentar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade de fluorescência. Plot dados fluorescentes como Af / F, com F sendo o valor médio basal de fluorescência. Uma descrição pormenorizada da análise dos dados de cálcio pode ser encontrada na literatura ^20.

5. AMI paralela de múltiplas Worms

1. Coloque o prato contendo os microchambers para o microscópio, concentrar-se na amostra e envolver o autofocus. Configurar um protocolo de software de modo que a câmera adquire uma explosão de 40 quadros de imagem em 20 segundos a cada meia hora, durante 24 horas, o que resultará em 1.920 quadros por verme, uma quantidade razoável de dados. Configurar a digitalização para que ele visita cada verme utilizando o palco. Destinam-se a filmar cerca de 30 vermes em uma corrida.
2. Imagem vários vermes por zoom out, ou seja, usando uma ampliação menor. Use uma menor ampliação para cobrir várias microchambers com o chip da câmera e filmar vários microchambers adjacentes simultaneamente. Após o final da aquisição da imagem, separar os dados de cada câmara individual do recorte de uma região de interesse cobrindo um animal.
3. Para avaliar rapidamente os dados de mobilidade, utilize quadro subtração ^28-32.

6. de imagem Fases da vida diferentes de C. elegans

1. Use microchambers agarose para todas as fases da vida de C. elegans de L1 para adulto e incluindo dauers. Use as dimensões da câmara apropriadas para differentes fases da vida que são mostrados na Tabela 1.

Estádio de vida	Tamanho da câmara	Profundidade da câmara	Tempo de gravação normal	Ampliação
L1	190 x 190 mm	10 - 15 uM	ovo - meados L2	400X
L2	370 x 370 mm	15 uM	ovo - L3	200X
Dauer larva	370 x 370 mm	25 uM	4 dias	200X
L3	700 x 700 ^ M	45 uM	L2 - L4	200X
L4	700 x 700 ^ M	45 uM	jovem L4 - jovem, adulto	100X
Jovens adultos	700 x 700 ^ M	45 uM	12-24 hr	100X

Tabela 1. Câmara tamanhos para diferentes fases da vida. Mostrado são dimensões da câmara e ampliações que são úteis para várias fases optimizadas para um chip de câmara de 8 x 8 mm.

Results

Microcâmaras de agarose pode ser aplicado a qualquer fase da vida de C. elegans. Como pode ser observado na Figura 1A, o desenvolvimento das larvas e do comportamento do sono durante lethargus L1 pode ser observada. São mostrados os tamanhos de câmara que são 190 x 190 mm, 10 um de profundidade. Se forem necessários escalas de tempo mais longos, maiores câmaras pode ser utilizado. Como pode ser visto na Figura 1B, utilizando uma câmara com dimensões maiores (370 x 370 mm, 25 um de profundidade) permite o desenvolvimento de C. elegans do ovo até adulto. A Figura 1C mostra uma análise das mudanças a longo prazo no comportamento usando quadro subtração de um verme crescido em uma câmara de ovo até adulto. São mostrados intensidades médias após quadro de subtração para rajadas selecionados durante velório e lethargus. Quanto mais baixa a intensidade média após subtracção valores armação é, quanto menor for a mobilidade do sem-fim. Mostrado são selecionados vestígios de ruptura de uma condição de vigília e uma condição lethargus por estágio larval. Oaumento observado na média intensidade durante o desenvolvimento é principalmente devido ao aumento do contraste e tamanho do animal. Figura 1D mostra uma larva Dauer, um estágio de vida alternativo que está envolvida em condições ambientais adversas ^33. Tamanho da câmara é de 370 x 370 mm, 15 um de profundidade. Note-se que a larva Dauer foi colocado para dentro da câmara sem alimentos bacteriana, o que causaria saída da fase larval dauer. A Figura 1E mostra um verme adulto que já estabeleceu muitos ovos para dentro da câmara. Dimensões da câmara utilizada para o adulto foram de 700 x 700 mm, 45 um de profundidade. Finalmente, a Figura 1F mostra um hermafrodita adulto e um acoplamento macho no interior de uma câmara de adulto.

Imagem de cálcio em vermes motilidade é possível com sensores de cálcio GCaMP. As Figuras 2A, B mostram imagens de cálcio do comando interneurônio AVA para uma larva L1 ^27. As Figuras 2C, D mostram a atividade de cálcio para a same tipo de neurônio em um animal adulto.

Intensificação de imagem a longo prazo é possível através da digitalização e fazendo zoom out. Figura 3A mostra a qualidade da imagem de gravação simultânea de 30 vermes em um só chip da câmera com uma câmera de 5 megapixels. Figura 3B mostra a qualidade de imagem de 4 de vermes cálcio iluminados simultaneamente.

Figura 1. Adaptação da AMI para todas as fases de vida de C. elegans. (A) Larva trabalhada desde o início até à fase L1 L2 no início de 190 x 190 mm ​​câmaras. (B) O desenvolvimento do ovo até adulto em uma câmara de 370 x 370 mm. (C) Mobilidade de um verme avaliada utilizando quadro subtração. É mostrada a intensidade média de todas as imagens da imagem após a subtração moldura para um filme explosão selecionado para cada sta larvalge para velório e comportamento lethargus. (D) Uma larva Dauer na ausência de comida numa câmara de 370 x 370 uM. Hermafrodita (E) Adulto com muitos ovos colocados em uma câmara de 700 x 700 mm. (F) de acoplamento de um macho e uma hermafrodita dentro de uma câmara 700 x 700 | im. YA significa jovem adulto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagem de cálcio com a AMI. (A) Imagem de cálcio com GCaMP3 no interneurônio AVA de larvas L1 usando o RMN-1 promotor de comando. São mostradas duas imagens de cores falsas. Na imagem à esquerda, a atividade de AVA é baixa eo bicho não está fazendo um movimento para trás. Na imagem da direita a atividade de AVA é alta, eo worm está se movendo para trás. transientes (B) de cálcio ao longo do tempo para um worm de L1. (C, D) transientes de cálcio em um animal adulto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Imaginologia vários vermes em paralelo por diminuir o zoom. (A) de imagem simultânea de 30 vermes L1 por quadro usando 190 x 190 mm ​​câmaras e uma ampliação de 100X (usando uma objetiva de 10X) e um chip da câmera 16,6 x 14 mm. (B) imagem simultânea de quatro vermes L3 por quadro, utilizando 370 x 370 uM câmaras e uma ampliação de 100X e uma região de interesse de um chip câmara 16,6 x 14 mm.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Equipamento

O foco de um microscópio normalmente deriva durante a aquisição de imagem a longo prazo. Para microscópios compostos, o foco de manutenção de sistemas podem ser adquiridos a partir dos principais fabricantes de microscópios. No caso de um microscópio composto com controle de foco é muito caro, uma alternativa simples seria usar um microscópio estereoscópico. Microscópios compostos permite o uso de objectivos com elevada abertura numérica (NA) e pode ser facilmente automatizado. Objectivos de petróleo 40X estão bem adaptados. Lentes de imersão em água não são ideais por causa da evaporação durante a imagem a longo prazo. Contraste de interferência diferencial (DIC) gera um contraste agradável que ajuda a acompanhar as alterações morfológicas e comportamentais, mas simples imagem de campo claro, também pode ser usado. Para DIC ou imagiologia campo brilhante, usar luz vermelha por colocação de um filtro de luz vermelha para o caminho do dia-a iluminação do microscópio. Para a digitalização de vários microchambers uma etapa automatizada é necessária. Melhor desempenho é achieved quando uma etapa é usado que tem aceleração e desaceleração não-linear e pode ser ajustado para baixo velocidade de digitalização para evitar perturbar os animais durante a digitalização. Não observamos respostas comportamentais ou aumento de cálcio nos neurônios mechanosensitive (ALM e PLM) durante a digitalização, o que sugere que a digitalização lenta na verdade não ativa o sistema mechanosensitive do worm (dados não mostrados). Sistemas comerciais de LED pode ser usado. Várias empresas oferecem soluções prontas para uso, que incluem os LEDs em diferentes comprimentos de onda. O LED deve ter a opção de desencadear externamente o LED com um sinal TTL. Uma câmera altamente sensível é necessário para geração de imagens de cálcio de mover os animais. Câmeras EMCCD são as câmeras mais sensíveis no mercado. A câmera precisa ter uma saída TTL durante a exposição (também chamado de saída "fogo"). Um aquecedor de tampa é necessário para evitar a condensação sobre a tampa se utilizando um microscópio invertido. Em um microscópio vertical, o prato vai ser colocada de modo que a tampa Wiestará na parte inferior e, assim, evitar condensação e sem aquecimento tampa é necessária. A tampa deve fechar-se hermeticamente o recipiente para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo.

PDMS selos

A superfície do selo PDMS que contém a estrutura de moldagem para a agarose é Moderada da lâmina de vidro, que suporta o selo PDMS. Uma lista com as empresas que oferecem chips personalizados microfluídicos podem ser encontrados no Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Encher os nematóides em suas câmaras

Este é o passo mais crítico no protocolo e os seguintes pontos devem ser considerados: A) A umidade do agarose é crucial para a transferência dos vermes e para a imagem latente. Se a agarose é muito úmido, ou seja, há uma cov líquidorando uma área de vários microchambers, não será possível para distribuir alimentos de bactérias e vermes de uma maneira controlada, porque o líquido irá tornar as bactérias escoar-se. Se a agarose é muito seco, em seguida, as bactérias e vermes não pode sair da picareta facilmente o que significa que o aumento da força precisa ser usada para soltar os vermes e bactérias que facilmente provoca danos ao agarose. Ao preencher um monte de vermes a agarose pode secar. No pior dos casos a agarose será tão seco no final que as câmaras entrará em colapso. Se a agarose é demasiado seco pode ser re-hidratado, colocando uma pequena gota (cerca de 2 ul) de S-basal para o lado do chip onde não existem vermes. Em seguida, mergulhar o fio de platina pegar no líquido e até mesmo puxar algum do líquido para dentro da área onde as câmaras são cheias com vermes. B) A quantidade de alimentos é fundamental para a imagem latente de sucesso a longo prazo. Se não há comida suficiente, os vermes podem ficar sem ele. Se houver excesso de comida na cavidade da câmaranão se comportará como um líquido, mas sim como um sólido e permitirá vermes para escapar da câmara, empurrando as bactérias. Destinam-se a obter uma suspensão bacteriana que preenche toda a câmara. Os vermes estão em constante contacto físico com a superfície de agar e de vidro ao longo da maioria do seu comprimento durante a experiência e a rastejar comportamento parece ser similar ao movimento sobre um prato e diferente de debulha em líquido. C) Mecânica prejudicial do agarose pode arruinar a experiência. Uma escolha bem é essencial. Ele não deve ter cantos afiados. Uma pestana macio ligado a uma ponta de pipeta pode ser usado para mover as bactérias ou vermes para dentro das câmaras, em vez de usar uma palheta de platina. Na maioria dos casos, no entanto, completamente seca de agarose é a razão para danos. A picareta ou cílios deve, idealmente, apenas a apenas tocar a própria agarose, e a película de água na superfície da agarose deve retirar vermes e bactérias. Quando as câmaras de selagem, mais uma vez, a humidade da agarose é essencial. Não deveser qualquer líquido livre na superfície de agarose porque esta pode lavar as bactérias e os vermes durante a selagem. Grandes bolhas pode ser removido levantando suavemente um canto da placa de agar. Pequenas bolhas que são menores do que a câmara muitas vezes ficam presos dentro das câmaras. Essas bolhas não são um problema e vai desaparecer por absorção. Depois de montar o prato, verifique novamente que a agarose não é muito seco nem muito úmido. As câmaras devem ser bem vedados e não deve haver qualquer fluxo de líquido entre as câmaras. Se a agarose é muito úmido, as câmaras não veda corretamente. Worms pode escapar ou seus alimentos serão lavados. Se a amostra for muito úmido, simples abrir a tampa e deixe secar agarose por um minuto ou dois. Se a agarose é muito seco, as câmaras podem entrar em colapso e os vermes vai escapar.

Intensificação por diminuir o zoom

Para imagens de fluorescência, zoom out é limitada pela baixa quantidade de luz obtida em ampliações inferiores. Além disso, ECâmeras MCCD são otimizados para a sensibilidade e muitas vezes têm uma resolução relativamente baixa. No entanto, ampliação de imagem quatro vezes é bem possível. Por exemplo, quatro câmaras de 190 mm x 190 mm pode caber em um quadro quando usando 140x ampliação (conseguido através de um 20X Objective e uma câmera 0,7X de montagem) e um pixel 512 x 512, câmera de 8 x 8 mm. A câmera de alta resolução com um grande chip (como câmeras scmos, 16,6 milímetros x 14 mm Chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) otimiza a intensificação das DIC e brilhante imaging campo. Por exemplo, até 30 vermes L1 em 190 mm ​​x 190 mm ​​câmaras podem caber em cada frame da câmera ao usar um aumento de 100x (ver Figura 3). Em princípio, o zoom e a digitalização pode também ser combinados para obter um número ainda maior de animais. A maioria dos neurônios ficar muito bem em foco, de modo que apenas um plano focal precisa ser trabalhada. Se os neurônios são encontrados para sair do foco, AZ varredura usando uma unidade piezo podem ser tomadas a cada vez que point.

Adaptação a diferentes comportamentos

Este protocolo dá uma boa idéia do comportamento através de escalas de tempo. Obviamente, o calendário das explosões deve ser adaptado a diferentes comportamentos e fases da vida.

Limitações da técnica

Vários fatores limitam a duração da imagem. O mais importante é a quantidade de alimentos. Uma vez que a comida é consumida, parar o desenvolvimento de larvas. Assim, em pequenas câmaras (190 x 190 ^ m) vermes desenvolver até o estádio L3 e então prender. Se for necessária uma maior tempo de imagem, câmaras maiores têm de ser usado. A duração máxima da imagem latente a longo prazo está na gama de 2,5-3 dias. Se mais de imagem for necessária, as minhocas precisam ser recuperados e colocados em novas câmaras. Quando imagiologia vermes adultos, outra limitação é causada pela prole destes vermes. Vermes adultos põem ovos a partir do qual as larvas eclodem. Essas larvas também vai ficar dentro da câmara, Consumir alimentos, e podem perturbar a análise de imagem. Se prole é um problema, a solução é usar tanto adultos estéreis ou para colocar repetidamente os vermes em câmaras frescas. Para recuperar vermes, a laje de agarose contendo a câmara é cortado com um bisturi livre, é puxado para fora da lamela, e é colocado numa placa de NGM a partir do qual os vermes podem ser recuperados. Outro limite é a restrição dos vermes para áreas relativamente pequenas. Isto pode ser um problema se o movimento de longo alcance deve ser analisado. Enquanto os animais nas câmaras pode ser estimulada mecanicamente e optogenetically ^21,27,34,35, a natureza estanque da câmara fará com que seja difícil aplicar estimulantes solúveis ou voláteis. Gases biologicamente importantes, tais como o oxigénio ou o dióxido de carbono podem livremente difundir no agar. O grande reservatório de ar no prato deve manter as concentrações de gases nas câmaras constantes durante o tempo necessário para as experiências. No entanto, deve ser mantido em mente que o Concentraçã oxigénio locaisn na câmara pode assemelhar-se mais as condições encontradas na cultura líquida do que na placa de cultura.

Significativas relativamente a métodos existentes

Dispositivos microfluídicos têm muito avançado comportamento e de desenvolvimento estudado em C. elegans. Frequentemente, as estruturas são feitas de microfluidos de PDMS ^12. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de câmaras de cultura de microfluidos feitas a partir de agarose. A força desta técnica é a combinação de alta qualidade de imagem, a correlação de comportamento com as medições fisiológicas, imagiologia de longo prazo, e um razoavelmente elevado rendimento. Alta qualidade de imagem é obtida por imagem através da lamela de vidro usando objetivos elevados de NA. Como resultado, imagens de fluorescência, tais como imagiologia de cálcio e de imagem confocal de estruturas subcelulares pode ser realizada. Uma vez que os animais não são imobilizados como noutros sistemas, que permite um comportamento de correlação com as medições fisiológicas. Because os animais têm comida suficiente, eles continuam desenvolvendo permitindo imaging longo prazo. Este sistema pode imagem muitos vermes em uma corrida porque os animais estão restritos a suas câmaras definidas. Assim, este método pode ser facilmente dimensionado para cima ^9,27,34-36.

As aplicações futuras

Até agora, este sistema tem sido usado principalmente para estudar o comportamento do sono em C. elegans larvas L1. No entanto, a adaptação a todas as fases, será possível estudar uma grande variedade de comportamentos também em dauers e adultos. Uma grande variedade de comportamentos pode ser estudada com esta técnica que varia de acasalamento para a postura dos ovos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agirose de alto ponto de fusão	Fisher Bioreagents	BP (E) 164-1000
Top Vision agarose de baixo ponto de fusão	Thermo Scientific	R0801
Sistema LED	CoolLED	pE-2
Microscópio composto	Nikon	TiE
Estereomicroscópio	Leica	M5
EMCCD câmera	Andor	iXon 897	agora vendido como câmera iXon Ultra 897
sCMOS	Andor	Neo
Plasma limpador	Harrick	PDC-23G2
Aquecedor de tampa	MPI oficina	feito sob medida
Prato de plástico	Falcon	08-757-100A
Z-stage para o microscópio	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage para o microscópio	Prior	Proscan III
Carimbo PDMS	Abbott Laboratories	feito
Filtro de luz vermelha	Chroma	ET660/50m
35 mm Placa de Petri	Falcon	Falcon Placas de Petri descartáveis, Estéril, Corning
Fita adesiva dupla face	Sellotape/Henkel	dupla face 25 mm x 33 m	alternativamente, pode ser usada fita adesiva dupla face avançada da Rubance Adhesives.