Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.
Adfærd styres af nervesystemet. Calcium billeddannelse er en enkel metode i den transparente nematode Caenorhabditis elegans at måle aktiviteten af neuroner under forskellige adfærd. At korrelere neurale aktivitet med adfærd, bør dyret ikke immobiliseres, men bør være i stand til at bevæge sig. Mange adfærdsændringer opstår under lange tidsskalaer og kræver optagelsen over mange timer for adfærd. Det gør det også nødvendigt at kulturen ormene i tilstedeværelsen af føde. Hvordan kan orme dyrkes og deres neurale aktivitet afbildet over lange tidsskalaer? Agarose mikrokammer Imaging (AMI) er tidligere udviklet til kultur og observere små larver og er nu blevet tilpasset til at studere alle livsstadier fra begyndelsen L1 indtil den voksne etape af C. elegans. AMI kan udføres på forskellige stadier af C. elegans. Langsigtet calcium imaging opnås uden immobilisere dyrene ved hjælp af kort eksternt udløst eksponeringer comkombineret med en elektron multiplicere ladningskoblet anordning (EMCCD) kamera optagelse. Zoome ud eller scanning kan skalere op denne metode til at billedet op til 40 orme i parallel. Således er en fremgangsmåde beskrevet af billedet adfærd og neurale aktivitet over lange tidsskalaer i alle livsstadier af C. elegans.
Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.
Hardware
Fokus for et mikroskop vil typisk glide under billedoptagelse på lang sigt. For sammensatte mikroskoper, fokus-holde-systemer kan købes fra de store mikroskop producenter. I tilfælde af en forbindelse mikroskop med fokus kontrol er for dyrt, ville en simpel alternativ være at anvende et stereomikroskop. Sammensatte mikroskoper tillade brug af målene med høj numerisk apertur (NA) og kan let automatiseres. 40X olie mål er velegnede. Vand nedsænkning linser er ikke ideel på grund af fordampning under langvarig billeddannelse. Differential kontrast interferens (DIC) genererer en nice kontrast, der hjælper til at følge morfologiske og adfærdsmæssige ændringer, men simpelt lyse felt billeddannelse kan også anvendes. For DIC eller lyse felt billedbehandling, bruge rødt lys ved at placere et rødt lys filter i dia-belysning sti af mikroskopet. Til scanning af flere microchambers er nødvendig en automatiseret scene. Bedste præstation er achieved når et stadium anvendes der har ikke-lineær acceleration og deceleration, og kan indstilles til lav scanningshastighed at forhindre forstyrre dyrene under scanningen. Vi har ikke observeret adfærdsmæssige reaktioner eller calcium stigning i mekanosensitive neuroner (ALM og PLM) under scanning, hvilket tyder på at langsom scanning faktisk aktiverer ikke mekanosensitiv system ormen (data ikke vist). Kommercielle LED systemer kan anvendes. Flere selskaber tilbyder klar til brug løsninger, der omfatter dioderne ved forskellige bølgelængder. LED skal have mulighed for eksternt at udløse LED med en TTL signal. En meget følsomme kamera er behov for calcium billeddannelse af bevægelige dyr. EMCCD kameraer er de mest følsomme kameraer på markedet. Kameraet skal have en TTL output under eksponering (også kaldet "ild" output). Et låg varmeren er påkrævet for at forhindre kondens på låget, hvis du bruger et omvendt mikroskop. På en opretstående mikroskop, vil skålen placeres, så låget will være i bunden og dermed kondensvand forhindres, og ikke låg opvarmning er nødvendig. Låget bør stramt lukke fadet for at forhindre fordampning af vand under langvarig billeddannelse.
PDMS frimærker
Overfladen af PDMS stempel, der indeholder den struktur til støbning af agarose står for væk fra objektglasset, som støtter PDMS stempel. En liste med selskaber, der tilbyder tilpassede mikrofluide chips kan findes på Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Påfyldning nematoderne i deres kamre
Dette er det mest kritiske trin i protokollen og de følgende punkter betragtes: A) moistness af agarose er afgørende for at overføre orme og billeddannelse. Hvis agarose er for fugtigt, dvs. at der er en flydende covering et område med flere microchambers, vil det ikke være muligt at fordele bakteriel mad og orme på en kontrolleret måde, fordi væsken vil gøre bakterierne strømme bort. Hvis agarose er for tør så bakterier og orme kan ikke komme ud af pick nemt, hvilket betyder, at øget kraft skal bruges til at droppe de orme og bakterier, som let forårsager skader på agarose. Ved påfyldning i en masse orm agarosen kan tørre op. I værste fald agarosen vil være så tørt i sidste ende at kamrene vil kollapse. Hvis agarose er for tør, kan rehydratiseres ved at placere en lille dråbe (ca. 2 pi) af S-Basal på siden af chippen, hvor der ingen orme. Derefter dyppes platintråden pick i væsken og endog trække noget af væsken i det område, hvor kamrene er fyldt med orme. B) Mængden af fødevarer er afgørende for en vellykket langsigtet billeddannelse. Hvis der ikke er nok føde, kan ormene køre ud af den. Hvis der er for stor fødevarer hulrummet af kammeretvil ikke opføre sig som en væske, men snarere som en solid og vil tillade orme at undslippe fra kammeret ved at skubbe fra bakterierne. Søge at opnå en bakterieopløsning, der fylder hele kammeret. Ormene er i konstant fysisk kontakt med agaren og glasoverfladen langs det meste af deres længde under forsøget og gennemsøgning adfærd synes at være magen til bevægelse på en plade og ulig prygle i væske. C) Mekanisk beskadigelse af agarosen kan ødelægge eksperimentet. Et fint pick er afgørende. Det bør ikke have skarpe hjørner. En blød øjenvipper fastgjort til en pipettespids kan bruges til at flytte bakterier eller orme ind i kamrene i stedet for at bruge en platin pick. I de fleste tilfælde er det dog overtørret agarose er årsagen til skaden. Pick eller øjenvipper bør ideelt set kun lige røre agarose selv, og vandfilmen på agarose overflade skal trække ud orme og bakterier. Når forsegling kamrene, igen, er væsentlig fugten af agarosen. Der bør ikkevære enhver fri væske på agarose overflade, da dette kan vaske væk bakterier og orme under forsegling. Store bobler kan fjernes ved forsigtigt at løfte et hjørne af agar plade. Små bobler, der er mindre end kammeret ofte bliver fanget inde i kamrene. Disse bobler er ikke et problem og vil forsvinde ved absorption. Efter montering fadet, kontrollere igen, at agarose ikke er for tør eller for vådt. Kamrene bør pænt forseglet og der bør ikke være nogen strøm af væske mellem kamrene. Hvis agarose er for vådt, vil kamrene ikke forsegle korrekt. Orme kan flygte eller deres mad vil blive skyllet væk. Hvis prøven er for fugtigt, simple åbne låget og lad agarose tørre i et minut eller to. Hvis agarose er for tør, kan kamrene kollapse og ormene vil undslippe.
Opskalering ved at zoome ud
Til fluorescens billeddannelse, er zoome ud begrænset af den lave mængde lys opnået ved lavere forstørrelser. Også, EMCCD kameraer er optimeret til følsomhed og ofte har en relativt lav opløsning. Men opskalering billeddiagnostik fire gange er vel muligt. For eksempel kan fire kamre i 190 um x 190 um passe på en ramme, når du bruger 140x forstørrelse (opnået ved hjælp af en 20X Målsætning og en 0,7x kamera mount) og en 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm kamera. En høj opløsning kamera med en stor chip (såsom sCMOS kameraer, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixels = 5.5 Megapixel) optimerer optrapning af DIC og lyse felt billeddannelse. For eksempel op til 30 L1 orme i 190 um x 190 um kamre kan passe på hver ramme af dette kamera, når der anvendes en 100 x forstørrelse (se figur 3). I princippet zoome ud og scanning kan også kombineres for at opnå endnu større antal dyr. De fleste neuroner bo ganske godt i fokus, således at kun én fokale plan skal afbildes. Hvis neuroner findes at flytte ud af fokus, AZ scanning ved hjælp af en piezo-drev kan tages på hver gang pFælles.
Tilpasning til forskellige adfærdsmønstre
Denne protokol giver en god idé om adfærden på tværs lange tidshorisonter. Naturligvis skal tilpasses forskellige adfærd og livsstadier timingen af byger.
Begrænsninger af teknikken
Flere faktorer begrænse varigheden af billeddannelse. Det vigtigste er mængden af fødevarer. Når maden er forbrugt, larver stoppe udviklingen. Således i små kamre (190 x 190 um) orme udvikler indtil L3 scenen og derefter arrestere. Hvis der kræves længere tid billeddannelse, større kamre skal anvendes. Den maksimale varighed af langsigtet billeddannelse er i intervallet 2,5-3 dage. Hvis længere billedbehandling er påkrævet, orme skal inddrives, og placeres i nye kamre. Når billeddannelse voksne orme, er en anden begrænsning forårsaget af afkom af disse orme. Voksne orme lægge æg, hvorfra larver udklækkes. Disse larver vil også bo inde i kammeret, Forbruge fødevarer og kan forstyrre billedanalyse. Hvis afkom er et problem, en løsning er at enten bruge sterile voksne eller gentagne gange placere orme i friske kamre. At inddrive orme er agarose plade indeholdende kammeret skåret fri med en skalpel, trækkes af dækglasset, og anbringes på en NGM plade, hvorfra ormene kan udvindes. En anden begrænsning er begrænsningen af ormene til relativt små områder. Dette kan være et problem, hvis langtrækkende bevægelse skal analyseres. Mens dyr i kamrene kan stimuleres mekanisk og optogenetically 21,27,34,35, vil den forseglede arten af kammeret gør det vanskeligt at anvende opløselige eller flygtige stimulanser. Biologisk vigtige gasser, såsom oxygen eller carbondioxid kan diffundere frit i agaren. Den store luft reservoir i skålen bør holde koncentrationerne gas i kamrene konstant over den nødvendige tid til eksperimenter. Imidlertid skal det holdes for øje, at den lokale ilt concentration i kammeret kan ligne mere de forhold, der findes i flydende kultur end kultur på pladen.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Mikrofluidenheder har i høj grad avancerede adfærdsmæssige og udviklingsmæssige undersøgt i C. elegans. Ofte er mikrofluide strukturer fremstillet af PDMS 12. Her beskriver vi en protokol til at generere mikrofluide kultur kamre lavet af agarose. Styrken ved denne teknik er kombinationen af høj billedkvalitet, korrelation af adfærd med fysiologiske målinger, langsigtet billedbehandling og et rimeligt højt gennemløb. Høj billedkvalitet opnås ved billeddannelse gennem dækglas anvendelse af høje NA mål. Som et resultat heraf kan fluorescensimagografi såsom calcium billeddannelse og konfokal billeddannelse af subcellulære strukturer skal udføres. Fordi dyrene ikke immobiliseres ligesom i andre systemer, gør det en korrelation af adfærd med fysiologiske målinger. BecABrug dyrene har rigelig mad, fortsætter de udvikler tillader langsigtet billeddannelse. Dette system kan billede mange orme i et løb, fordi dyrene er begrænset til deres definerede kamre. Således kan denne fremgangsmåde let opskaleres 9,27,34-36.
Fremtidige applikationer
Hidtil har dette system hovedsageligt blevet anvendt til at studere søvn adfærd i C. elegans L1 larver. Tilpasning til alle faser, vil dog gøre det muligt at studere en bred vifte af adfærd også i dauers og voksne. En bred vifte af adfærd kan studeres med denne teknik lige fra parring til æglægning.
The authors have nothing to disclose.
Max Planck Society og en Göttingen Graduate School Junior Group stipendium til HB finansierede dette arbejde.
high-melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
Top Vision Low Melting Point Agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
LED system | CoolLED | pE-2 | |
compound microscope | Nikon | TiE | |
stereomicroscope | Leica | M5 | |
EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
lid heater | MPI workshop | custom made | |
plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
x-y-stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
red light filter | Chroma | ET660/50m | |
35mm petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 12mm x 33 m | alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |