Aqui é descrito o método para estabelecer um modelo singênico de tumor ortotópico de bexiga em camundongos para avaliar a eficácia antitumoral da proteína bacteriana HP-NAP.
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Resumo
Resumo
O câncer de bexiga é uma das neoplasias malignas mais comuns do trato urogenital. A injeção intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) é o tratamento padrão-ouro para o câncer de bexiga não invasivo muscular de alto grau (NMIBC). No entanto, como os efeitos colaterais relacionados ao tratamento são relevantes, são necessários novos modificadores de resposta biológica com uma melhor relação benefício/efeitos colaterais.
O microambiente tumoral pode influenciar tanto o desenvolvimento do tumor quanto a eficácia da terapia. Para obter um bom modelo, é desejável implantar células tumorais no órgão de onde o câncer se origina.
Neste protocolo, descrevemos um método para estabelecer um tumor na cavidade da bexiga de camundongos fêmeas e subsequente entrega de agentes terapêuticos; estes últimos são exemplificados pelo uso da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori (HP-NAP). Uma queimadura química preliminar da mucosa, seguida pela injeção da linha celular de carcinoma urotelial de camundongo MB49 via cateterismo uretral, permite que as células se liguem à mucosa da bexiga. Após um período, necessário para permitir uma proliferação inicial das células, os camundongos são tratados com HP-NAP, administrado novamente por cateterismo. A atividade antitumoral do HP-NAP é avaliada comparando o volume do tumor, a extensão da necrose e o grau de vascularização entre os animais tratados com veículo e HP-NAP.
Introdução
O câncer de bexiga é um dos cânceres mais comuns do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos por ano nos EUA 1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida exigem acompanhamento, o que torna o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. O tratamento padrão ouro para o alto grau NMIBC é a ressecção trans-uretral, seguida de imunoterapia intravesical com BCG. Embora o mecanismo exacto da actividade anti-tumoral de BCG continua a ser totalmente elucidado, admite-se que a activação de uma resposta imune mediada por células enriquecida em células T auxiliares (Th) e um T citotóxicas (Tc) um células é crucial para o sucesso da terapia de ....
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Protocolo
Todos os procedimentos para lidar com os animais foram aprovados pelo Ministério italiano da Saúde (204/2011-B DM).
1. Os animais
- Crescer camundongos fêmeas C57BL6 / J 8 semanas de idade em gaiolas ventiladas individualmente com filtros microisolation.
Nota: As fêmeas são preferidos devido à conformação anatómica do seu aparelho de uro-genital externa torna o cateterismo mais fácil do que nos machos.
2. Cultura celular
- Manter a linha celular de carcinoma urotelial rato MB49 em RPMI 1640 meio suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 50 ng / ml de genta....
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Resultados
A Figura 1 mostra a técnica de cateterização; o mouse é cateterizada e instilada com 0,5 × 10 6 células MB49. O tratamento com HP-NAP foi iniciado 3 dias após a injecção de células tumorais, para lhes permitir fixar à parede da bexiga e proliferar. Todos os animais que pertencem ao grupo de controlo desenvolver o tumor; alguns deles podem morrer, antes do final do período de 13 dias, devido à oclusão da uretra.
Após a primeira injecção com HP-PNA, os animais são t.......
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Discussão
A maioria dos avanços na terapia do cancro requerem testes em modelos animais antes de começar testes clínicos. A possibilidade de estudar a biologia do tumor in vivo, aproveitando-se de modelos animais, representa uma ferramenta crucial para os pesquisadores que investigam patogênese do câncer, permitindo a avaliação de diferentes abordagens terapêuticas. Modelos ortotópicos sendo o padrão-ouro 14-15, tanto por causa da enorme quantidade de linhas celulares disponíveis para configurar um modelo de t.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italiano Ministério da Universidade e da Pesquisa, projetos Prin e Progetti di Ricerca di Ateneo, conceder N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, conceder N ° 2011-0485 para MDB, e por Finanziamento Giovani studiosi, da Universidade de Pádua, para Gaia Codolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | |||
| Camundongos fêmeas C57BL/6J | Harlan Itália (Udine, Itália) | ||
| Células | obtidas do Prof. O'Donnel, Universidade de Iowa Carver College of Medicine, Iowa, EUA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, para ser diluído em água apirogênica |
| Frasco | Becton Dickinson (Franklin Lakes, Nova Jersey, EUA) | 353135 | |
| Seringa 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, EUA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milão, Itália) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, França) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Roma, Itália) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Itália | )403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pensilvânia, EUA) | 10095011 | Pó |
| Equipamento | |||
| Bisturi Cirúrgico | Albion Surgical Limited (Sheffield, Inglaterra) | ||
| Micrótomo | Leica Microsystem (Wetzlar, Alemanha) | RM2235 | |
| Lâminas de Microscópio | VWR International (Radnor, Pensilvânia, EUA) | 631-0108 | |
| Analisador de Imagem | Zeiss (Jena, Alemanha) | Cyres System |
Referências
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. ....
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Reimpressões e permissões
