الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
توفر المقايسات خلية القاعدة أداة هامة لتطوير واكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. 1،2 تاريخيا، وقد استخدمت الثقافات أحادي الطبقة من الخلايا السرطانية للتحقيق كفاءة مركبات مرشح ضد أنواع معينة من الخلايا السرطانية. سهولة الصيانة الثقافات أحادي الطبقة في لوحات ثقافة القياسية، والتوافق لوحات القياسية مع الأدوات الروبوتية التجارية لإضافة الكواشف، ومع معدات الفحص لتحليل المصب من الاستجابات الخلوية إلى المركبات الكيميائية هي الفوائد الرئيسية التي تجعل الثقافات 2D أداة جذابة لاختبار المخدرات 3. لسوء الحظ، غالبا ما تفشل المقايسات خلية أحادي الطبقة التنبؤ فعالية من المركبات في الجسم الحي، مما يجعل تطوير العقاقير واكتشاف عملية مكلفة للغاية. وعلى الرغم من 4،5 استثمارات كبيرة وجهد من قبل شركات الأدوية والوحدات الأكاديمية، فقط ~ 1٪ المضادة للسرطان تمت الموافقة على المخدرات في التجارب السريريةمن قبل FDA على مدى العقدين الماضيين. 6 التفاوت بين الثقافات 2D و 3D البيئة المعقدة من الخلايا السرطانية في الجسم الحي هو أحد أوجه القصور الرئيسية لنظم الاستزراع أحادي الطبقة. 7 لذلك، وفحص المركبات مرشح ضد الخلايا السرطانية في الإعداد الذي أكثر شبها البيئة الورم 3D قد تعجل تطوير عقاقير العلاج الكيميائي الرواية. 8
الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية تقديم نموذج ورم 3D ذات الصلة في المختبر. 9،10 الأجسام الشبه الكروية هي مجموعات المدمجة التي تشكل من خلال التجمع العفوي أو المتعمد من الخلايا السرطانية على الأسطح غير ملتصقة أو في تعليق باستخدام تقنيات مثل قارورة الدوار، تراكب السائل، والصغرى microfabricated . كذلك المصفوفات، على microfluidics، وقطرات شنقا 11-16 الأجسام الشبه الكروية تحاكي الملامح الرئيسية الأورام الصلبة بما في ذلك الهندسة والنقل محدود من الأكسجين والمغذيات، والمركبات المخدرات في المنطقة الوسطى. وبالتالي، فإنها تتجدد بشكل وثيق respon المخدراتحد ذاته من الأورام الصلبة مقارنة الثقافات أحادي الطبقة. 17-19 وعلى الرغم من هذا الاستحقاق ملحوظة، لا تستخدم الأجسام الشبه الكروية بشكل روتيني لفحص المركبات الكيميائية ضد الخلايا السرطانية. صعوبة إنتاج الأجسام الشبه الكروية موحدة الحجم في إعداد إنتاجية عالية القياسية التي تتوافق مع الروبوتات المتاحة تجاريا وأدوات الفحص / التصوير تعرقل إدماج ثقافة كروي في خط أنابيب تطوير الأدوية. على الرغم من أن المواد المخصصة لوحات وأصبحت في الآونة الأخيرة المتاحة تجاريا لتلبية هذه الحاجة، اعتبارات التكلفة ردع استخدامها على نطاق واسع.
اثنين من التقنيات الرئيسية لديها القدرة على إنتاج الأجسام الشبه الكروية متناسقة الحجم في إنتاجية عالية استخدام منصة قطرة شنقا جديدة وmicrofabricated الآبار الصغيرة. 13،16،20 ومع ذلك، كلا النهجين تتطلب لوحات والأجهزة التي هي مكلفة لصنع وغير مريح للمستخدمين النهائيين الخاصة في مراكز البحوث الأساسية والصناعات الدوائية حيث EF معظم كبارمصنوعة الحصون لاكتشاف عقاقير جديدة مضادة للسرطان. وعلى الرغم من بعض التحسن في استقرار قطرات تحتوي على خلية مع تصميم حديث من شنقا لوحات قطرة، لا تزال تستخدم فقط كل حفرة الآخر من لوحة خلال ثقافة لتجنب انتشار / دمج قطرات. 16 هذا يقلل بشكل ملحوظ الإنتاجية التجريبية. إدمان المخدرات والتجديد صعبة مع دليل أو pipetting لالروبوتية وتحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى لوحة القياسية لتحليل الكيمياء الحيوية الكروية لهذا التكوين لوحة غير متوافق بسهولة مع معدات الفحص التقليدية مثل لوحة القراء. ملفقة 21 مايكرو الآبار باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة أيضا سماح حجم تسيطر إنتاج كروي. 13،20 ومع ذلك، عدم توافق هذه المنصة مع الأدوات القياسية pipetting ليمنع علاج من الأجسام الشبه الكروية الفردية مع مختلف المركبات الدوائية / تركيزات، وفضح كل الأجسام الشبه الكروية إلى حالة معاملة واحدة. وهكذا، وهذه الطريقة ليست مناسبة لارتفاعفحص مجمع الخرج الذي يتطلب الاختبار في وقت واحد من المركبات متعددة / التركيزات.
للتغلب على هذه العقبات، وقد تم تطوير تقنية جديدة لإنتاج إنتاجية عالية من الحجم باستمرار الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا القياسية. 22،23 ويستند هذا النهج على نظام مائي على مرحلتين البوليمر (ATPS) مع البولي ايثيلين جلايكول ( وقد تم مؤخرا استخدمت PEG) وديكستران (DEX)، والبوليمرات التي تشكل المرحلة 24 ATPSs في مجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية خلية جديدة لتمكين micropatterning الخلية والمترجمة تسليم الكواشف البيولوجية للخلايا في الوسط المائي للغاية. 25-32 تشكيل ل كروي، يتم خلط الخلايا السرطانية مع المرحلة DEX المائية وانخفاض-ميكروليتر الفرعية لتعليق الناتجة من pipetted إلى تحتوي أيضا على الغمر المائي حل المرحلة PEG. يبقى قطرة إمتزاج من مرحلة الغمر والخلايا حدود لتسهيل تشكيل كروي. عفريتortantly، مرحلة الغمر المائي للغاية توفر المواد المغذية للخلايا كروي ويقلل من مشكلة معروفة من التبخر وسائل الإعلام المشتركة لبعض المقايسات الأخرى التي تسبب التغيرات في الأسمولية وسائل الإعلام وتقلبات تركيزات المخدرات. هذه التقنية تتيح إنتاج كروي والعلاج من تعاطي المخدرات فقط باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا وأدوات pipetting لفي لوحات 96-جيدا القياسية. الأهم من ذلك، يتم إجراء تحليل الاستجابات الخلوية من الأجسام الشبه الكروية في نفس لوحة باستخدام فحوصات البيوكيميائية القياسية والقراء لوحة. سهولة العمل مع ATPS والقدرة على التكيف للنهج لمعالجة السائل الروبوتية يجعل الجيل إنتاجية عالية من كلا أحادية الثقافة وشارك في الثقافة الكروية تقنية المختبرات مباشرة. وهذا النهج الجديد سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام نحو تكامل الكروية الخلايا السرطانية في عمليات التنمية المخدرات والاكتشاف مع تحسين الإنتاجية الاختبار وفعالية التكاليف (زيادة أعداد المركبات وredu اختباراستهلاك دائرة الهندسة المدنية كاشف) والكفاءة (خفض اليدين في الوقت المحدد).
يوصف بروتوكول مفصل لإنتاج الروبوتية من الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية في لوحات 96-جيدا باستخدام نهج ATPS أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض تفاصيل العلاج من تعاطي المخدرات من الناتج الكروية وتحليل المصب من الاستجابات الخلوية باستخدام مقايسة البيوكيميائية التجاري.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأجسام الشبه الكروية تقديم نموذج واقعي لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء الورم ونجاعة الأدوية وتوفير أداة مفيدة لمكافحة السرطان اكتشاف الأدوية. ان مثل هذه التطبيقات تستفيد كثيرا من التقنيات البسيطة جيل كروي والصيانة التي تتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، والتعامل م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
Referências
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery–a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. . Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
