The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.
Fortsatt fremgang i pluripotent stamcellekultur lukke gapet mellom benk og sengen for å bruke disse cellene i regenerativ medisin, medisiner og sikkerhetstesting. For å fremstille stamcelle avledet biopharmaceutics og celler av vev og transplantasjon, er essensielt en kostnadseffektiv celle-produksjonsteknologien. Vedlikehold av pluripotency og stabil ytelse av celler i nedstrøms applikasjoner (f.eks celledifferensiering) over tid er viktig for storskala celleproduksjon. Likevel kan det være vanskelig å oppnå, spesielt hvis celler dyrkes manuelt, hvor operatøren kan innføre betydelig variabilitet, samt være prohibitivt kostbart å skalere opp. For å aktivere høy gjennomstrømming, storskala stamcelle produksjon og fjerne operatør innflytelse roman stamcelle kultur protokoller ved hjelp av en benk-top flerkanals væskehåndtering robot ble utviklet som krever minimalt med tekniker engasjement eller erfaring. Meddisse protokollene menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) ble dyrket i matefrie forhold direkte fra en frosset lager og opprettholdt i 96-brønners plater. Avhengig av cellelinjen og ønsket oppskalering rate, kan operatøren enkelt finne ut når du skal passering basert på en serie med bilder som viser de optimale koloni tettheter for splitting. Så de nødvendige reagenser er forberedt på å utføre en koloni split til nye plater uten sentrifugeringstrinn. Etter 20 passasjer (~ 3 måneder), to IPSC linjer opprettholdt stabile Karyotyper, uttrykt stamcellemarkører, og differensiert i cardiomyocytes med høy effektivitet. Systemet kan utføre påfølgende high-throughput screening av nye differensierings protokoller eller genetisk manipulering er utformet for 96-brønners plater. Denne teknologien vil redusere arbeidskraft og teknisk byrde å produsere et stort antall identiske stamceller for en myriade av applikasjoner.
Bruken av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) har økt betydelig siden deres avledning i 2007 1 for sammensatte testing, regenerativ medisin og sykdom modellering 2-6. Dette kravet kommer fra IPSC kapasitet til å gi et stort antall pluripotente celler som kan differensieres i somatiske celler på en enestående mengde. Som rettet differensiering teknikker forbedre 7-10 og utvikling av menneskelig celle eller vev modellering og celleterapi øker 11-14, så gjør behovet for masseproduksjon av høykvalitets iPSCs. Det er mye sitert som blant andre sykdommer, vil hjerteinfarkt eller b-celle funksjonell erstatning krever hundrevis av millioner til milliarder av IPSC avledet somatiske celler 15-18. Videre stadig mer komplekse 3D vev modellering for medisiner og therapy vil kreve et stort antall celler 9,13,19. I alle disse eksemplene, er definert, ensartede og reproduserbare iPSCs må være tilgjengelig og enkel å produsere.
For å fremstille stamcelle avledet biopharmaceutics og celler av vev og transplantasjon, er essensielt en kostnadseffektiv celle-produksjonsteknologien. Skalert produksjon av iPSCs har fokusert på suspensjonskultur 20 – 25 eller suspensjon med bruk av mikrobærer substrater 26-28 delvis fordi disse teknikkene er vellykket utplassert for storskala, ikke-IPSC, eukaryot basert produksjon. Flere grupper har demonstrert suspensjon dyrkingssystemer som gir pluripotente stamceller 20,21,23,24,29. Men disse metodene utnytte dyre og komplekse systemer ikke er lett tilgjengelige for forskere utvikler nye differensierings programmer, kjøring tissue engineering og gjør Laboratory skala forskning. Videre suspensjon og mikrobærer IPSC kulturer krever tilpasning og teknikker eller kjemikalier som ikke finnes i tradisjonell tilhenger IPSC kultur som kontinuerlig bruk av Rho-kinase inhibitor, antiskummidler og filtrering for å regulere aggregering. Fysisk stress til cellene er mer utbredt i suspensjonskultur, innført ved mekanisk agitering, så vel som i løpet av mikrobæreren kollisjon. Disse problemene begrenser forutsigbarheten og hastigheten som nylig genererte stamcellelinjene kan dyrkes i suspensjon. Andre har utviklet robot plate håndteringssystemer som etterligner platekulturteknikker 30,31, men disse plattformene kreve en betydelig investering for utstyr og kompetanse til å operere i tillegg til de grunnleggende utfordringer forbundet med stilk cellekultur.
Følgende arbeid beskriver utviklingen og praktiseringen av en skalerbar IPSC kultur system som utnytter en selvstendig, standard 8-kanals robot væskehåndterer og 96-brønners plater. Denne metoden ble utviklet for å bygge bro laboratorieskala IPSC kultur og høy-volum IPSC produksjon (for eksempel 10 7 til 1,5 x 10 9 celler per uke per tekniker) slik at de utvikler nye IPSC teknologi for enkelt å skalere opp produksjonen uten store hardware og arbeidstager investeringer. Denne fremgangsmåten er relativt billig å sette opp, krever lite eller ingen stilk cellekultur, programmering eller teknisk erfaring, har et lite fotavtrykk utstyr uten behov for en egen cellekultur hette, og benytter standard cellekultur utstyr for å muliggjøre middels til høy gjennomstrømning automatisert celleproduksjon. Målet var å utvikle et system som kan skaleres stamcelle kultur som kan benyttes av laboratorier nye til stamcelle kultur, de som finner manual kultivering en barriere for å utvikle sine ideer eller de som ønsker en økonomisk måte å produsere et stort antall stamceller. Plattformen som presenteres her fjerner tekniker innflytelse påstamcelle kultur og normaliserer fôring og passage prosedyrer for å aktivere konsekvent stamcelleproduksjon.
I den foreliggende undersøkelse har vi utviklet en metode for robot kultur for IPSC produksjon som miniaturizes og automatiserer foring og passasje i en 96-brønners plateformat, samtidig muliggjør effektiv oppskalering. En flytende håndtering robot ble brukt til rutinemessig mate IPSC kolonier og passage dem med jevne mellomrom ved enzymatisk dissosiasjon. Roboten er også programmert til å produsere ekstracellulær matriks gel-belagte plater, og utføre en seeding densitetsgradient. Når fibroblast og adipose avledet iPSCs ble dyrket i dette systemet i mer enn 20 passeringer, ca 3 måneder, ble pluripotency vedlikeholdt, som var stabile Karyotyper. Begge cellelinjer var i stand til differensiering til kardiomyocytter. Sammen, innsamling av protokoller beskrevet her lar brukere med svært liten stamcelle kultur erfaring, eller begrenset tilgang til spesialisert kultur utstyr, til kultur stamceller og oppnå høy celleproduksjon eller flere linjer håndtering med minimal arbeid og kostnader.
<p class = "jove_content"> Den robot protokollene beskrevet her tilveiebringe en fremgangsmåte for økonomisk skala opp fra IPSC produksjon og håndtering. En fordel er skalerbar stamcelle kultur i et etablert plate basert format demonstrert her og tidligere 44,47 – 49 for å opprettholde pluripotency. Mens andre formater av skalerbar stamcelle kultur avkastning pluripotente celler 20,23,29 denne platen basert metoden krever egentlig ingen endring i kultur-format, som tilpasning til suspensjon, bruk av antiskum kjemikalier eller langvarig bruk av Rho-kinase inhibitor 20. Denne platen basert metode kan derfor raskt og forutsigbart, imøtekomme nye linjer fordi forholdene kultur er like. Som bruk av iPSCs for sykdom modellering øker 4,6,19,50, nye IPSC linjer kontinuerlig generert. Teknikkene som beskrives her er best egnet til kultur nye linjer i middels til høyt volum og gjennomstrømning fordi barrieren til overgangen til formatet er low. Dette gjelder også for arbeidskraft og utstyr som er nødvendig for å opprettholde koloniene. Til slutt, fordi formatet og håndtering er lik miljø som brukes for å avlede og validere IPSC linjer, kultur ytelse, slik som anvist differensiering, vil sannsynligvis være mer forutsigbar.Figur 8 illustrerer en strategi for oppskalering av stamcelle produksjon i 96-brønners plater. En plate (Cycle 0) brukes til robot frø 12 nye plater, en 12 ganger økning (syklus 0-1). Etter flere dager med foring, en av de tolv plater er passaged til frø annet sett av tolv plater (Cycle 1 til Cycle 2). De gjenværende elleve platene er nå tilgjengelig for andre formål og som representerer produksjonen komponent i systemet. På denne prisen, vil passering av en plate gi 11 plater hver syklus, eller hver 3-4 dager. Denne metodikken kan skaleres mer når flere plater er passert, som vist i overgangen fra syklus til syklus 2 3. I syklus 3, to platene erpleide alltid å opprettholde koloni og frø 24 nye plater. De resterende 22 platene er deretter tilgjengelige for anvendelse etter hver passering syklus. På noe punkt i vedlikeholdssyklusen brukeren kan seede flere plater for å øke produksjonen. Ett eksempel ville være å passasje hver kolonne for to vekstsykluser. Den første passasje omdanner en plate i tolv plater, og hver av de tolv plater som grunnlag 144 plater. I dette tilfellet starter en bruker med en plate, og etter to passeringer, eller ca 1,5-2 uker med kultur, har platene 144. For eksempel fibroblast og adipose IPSC linjer gi ca 25-75 millioner celler per 96-brønns plate når du er klar til passering. 144 plater kan derfor representere ca 4-7 x 10 9 celler.
Hva er arbeidsbelastningen for å bære 144 96-brønners plater med roboter? Ett av målene for dette arbeidet var skalerbar stamcelle produksjon som redusert arbeidskraft sammenlignet med tradisjonelle (dvs. seks-brønns plate) stamcelle kultur. Roboten accomplishes dette ved å lindre behovet for å fysisk håndtere hver plate under fôring og passaging. Mens 96-brønners plate produksjonsskalaer lineært som det ville i tradisjonelle seks-brønns plater, er tiden en tekniker bruker arbeider med platene betydelig mindre ved hjelp av robot kultur. Den produksjonseffektivitet av robot kultur er avledet fra denne forskjellen (figur 9). Det ble funnet teknikere kunne fjerne en seks-brønns plate fra inkubatoren, sjekk det på mikroskopet, deretter aspirer og mate plate i ca 3,5 minutter. Til sammenligning teknikere bruke ca 30 sekunder å fjerne en 96-brønns plate fra inkubatoren og inspisere den på mikroskop for tetthet og forurensing før du legger den på roboten. Med et utvidet mate protokoll som ligner den som er beskrevet ovenfor, kan seks 96-brønners plater lastes og mates, noe som tar omtrent 21 min, eller 3,5 min per plate. Den totale medgått tid til å mate en plate er sammenlignbar mellom robotic og manuelle metoder, men å levere strøm 6 plater en tekniker kreves for alle 21 minutter mens teknikeren bruker kun 3 min håndtering av seks plater for roboten (30 sek inspeksjon per plate). Som figur 9 viser, den tiden en tekniker bruker håndtering 144 plater ved hjelp av roboten er ca 1,2 time i motsetning til 8 timers manuelt og roboten vil aldri gjøre en feil håndtering av plater eller overføring væsker.
De 96-brønns dyrknings IPSC metoder som er beskrevet her gir en bearbeidbar plattform for screening komplekse oppgaver. Fordi hver brønn er genetisk identiske, og podet på samme tetthet fra den samme opprinnelige bassenget, kan variablene bli fordelt over platen og opprettholdes av roboten med kommersielt tilgjengelige reservoarer for å skille betingelser. Dette vil være nyttig for eksperimenter som stamcellevekstmedier utvikling 34,35,47, substrat eller kultur tilstand testing og toksisitetsstudier utnytte stamceller51. Siden hver stamcellelinje er unik når det gjelder optimale kolonistørrelse og passasje krav, kan man bruke dette systemet for å modulere såing tetthet, å mate frekvens og passasje håndtering ved å manipulere kolonnene høstet, mekanisk omrøring under passasje og foring frekvens. Itera gjennom disse variablene vil tillate brukeren å raskt finne et sett med betingelser som er egnet for dyrking av en ny linje eller utvikle nye kulturteknikker. Robotsystemet er også i stand til å opprettholde 96 parallelle, men uavhengige stilk cellekolonier. Når IPSC er avledet fra somatiske celler eller klonet etter genetisk manipulasjon, er mange parallelle kloner skjermet for å gi potensielle IPSC linjer. Når enkle celler blir sådd ut i 96-brønners plater, kan dette systemet mate og passasjen 96-brønners plater som holder hver koloni adskilt. Dette muliggjør meget høy gjennomstrømning ved valg av mulige kloner og eliminerer vanskeligheten med fysisk dyrking av 96 parallelle linjer. Denne metoden også enllows oppskalert produksjon av hver klon, slik at materiale som er lett tilgjengelig for parallell analyse. Til slutt ser vi for oss å integrere disse kultur teknikker med en robot plate trafficking system som leverer plater til og fra inkubatoren muliggjør helautomatisk kultur. Dette kan gjøres med mer komplekse robotikk som gir mulighet for større utvidelse siden de grunnleggende protokoller som er beskrevet her er overførbare til andre platebaserte systemer.
De første viktige skritt for å løse i protokollene er de som forebygge og kontrollere for forurensning som steg 1,5 og 4,2. Forurensning, som omtalt ovenfor, kan med hell unngått dersom gode steril teknikk og sunn fornuft blir utnyttet. Det er viktig, uavhengig av stamcelle kultur format, som operatøren sjekk for forurensning og å gjøre det i denne protokollen på de angitte trinnene vil i betydelig grad redusere risikoen for forurensning. Riktig ekstracellulære matrise gel programmet er en annen essential skritt for å lykkes med denne protokollen. Uten riktig belegging av 96-brønners plater, vil stamcellene ikke vokse. En vanlig problem er ufullstendig godt belegg. Erfaring har vist at luftbobler, elektrostatisk tiltrekning og kapillarvirkningen hindrer fullstendig godt belegg. Den pre-fuktende trinn (1,6) ble utviklet for å forbedre brønnbunnen belegg og bør ikke bli hoppet over. Dette forhåndsfuktetrinn synes å redusere den tilsynelatende hydrofobisitet av plast 96-brønns plate, slik at når den ekstracellulære matriks gel belegg påføres den er jevnt fordelt over brønnens bunn og sider. Det anbefales også å banke forsiktig på 96-brønners plater mot en ren hånd når belagt for å sikre enda ekstracellulære matrise geloppløsning distribusjon. Dissosiasjon parametere er også viktig å optimalisere. Utvidet inkubasjon med enzym eller EDTA basert dissosiasjon reagens vil resultere i enkeltceller som kan eller ikke kan være målet i løpet av passasjen. Derfor operatørenbør være spesielt oppmerksom på hvordan dissosiasjon tid, utgnidning kraft, og vaske repetisjoner påvirke kolonimorfologi og helse og justere deretter.
Forstå begrensningene til de teknikkene som er beskrevet her er viktig for vellykket operasjon. Som i alle andre cellekultur omgivelser, som gjør bruk av 96-brønners plater en relativt høy risiko for forurensning. Som beskrevet ovenfor, er en tekniker håndtering av hver plate under mating og aging; for eksempel når du åpner lokket, setter platen på roboten seng, og sjekke platen på mikroskopet. Derfor, som nevnt etter trinn 1.5, er det viktig ikke å ta på innsiden av en plate lokk eller utsette denne delen til noen potensielt forurensede overflaten slik som de skrå varmeblokker eller vertikale pinnene på sengen. Under protokollen utvikling denne begrensningen ble oppdaget og var drivkraften for å utvikle et stativ for å holde platelokk for å opprettholde sterilitet. Likeledes renne reservoarer, pipettespisser og other forsyninger på væskehåndtering robot seng er potensielle kilder til forurensning fordi de er åpne for miljø og håndteres av teknikeren. Derfor bør god steril teknikk anvendes, slik som å redusere bevegelsene i løpet av eksponerte kultur materialer eller åpne væsker. En annen begrensning er at når protokollen er skalert opp, visuelt kontrollerer hver brønn på> 100 96-brønners plater er tungvint. Dette kan håndteres ved visuell inspeksjon av hele platen for tegn på forurensning, slik som turbid medium, for å identifisere mistenkelige brønner. For fremtidig skala opp, vil bruk av et automatisert mikroskop og indikator på cellevekst og potensiell forurensning inkorporeres.
I sammendrag, high-throughput 96-brønn basert plattform er beskrevet her gir en reproduserbar, high fidelity fremgangsmåte for stamcellekultur og produksjon i et plateformat. Denne metoden reduserer den nødvendige erfaring, nødvendig utstyr og arbeidskraft tid dedikert til stamcelle kultur mensopprettholde fordelene ved tradisjonell heft kultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har vært støttet delvis av NIH tilskudd, R44 GM087784 og R01 HL109505. Forfatterne takker den tekniske og OEM teamet på Gilson, INC for utvidet teknisk support.
96-well plates | Corning | 3596 | 96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped |
Seahorse Trough | SeahorseBio | 201308-100 | Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs |
Gilson Tips | Gilson | F167023 | 10 racks gilson 96tips D200 tips |
DMEM/F12 | Life Technologies | 12500062 | DMEM/F12 powder. Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter. |
Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 354230 | Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 mL |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 5857 | mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance. |
E8 Media | StemCell Technologies | 5940 | TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance |
Y27632 | AdooQ BioScience | A11001-50 | Rock inhinitor Y-27632 2HCI |
Accutase | Innovative Cell Technologies | ACCUTASE | Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 mL sterile cell solution |
PBS | Fisher | SH30256FS | PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk |
Gilson PIPETMAX | Gilson | PIPETMAX | http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk |