En optimerad anrikningsteknik för isolering av<em> Arthrobacter</em> Bacteriophage Arter från jordprov Isolerar
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
Den gränslösa Arthrobacter arter i markmiljöer erbjuder ett stort antal och mångfald av fager som kan isoleras från denna art av värdbakterier. Bakterie medlemmar av Acintobacteriaceae familjen är mest känd för sina katabola vägar förnedrande motsträviga föreningar som atrazin och diverse andra bekämpningsmedel och herbicider 1,2,3. Även om de flesta forskning har gjorts med hjälp av miljö stammar av Arthrobacter, är kliniska isolat av detta släkte som finns i blod, urin, ögon, och många andra mänskliga källor alla visar fylogenetiskt heterogenitet 4.
Medan det finns en ganska omfattande mängd forskning på Arthrobacter bakterier, bara ett fåtal studier rapportera om fager som kan infektera medlemmar av denna skiftande släkte. Intressant dock, arbete tidigare på Arthrobacter fagerna handen på flera viktiga distinkta ämnen såsom typning av jord <em> Arthrobacter arter 5, industriellt bruk med syfte att minska skadlig skum i aktiverade slamanläggningar 6, och arbetet belyser platsspecifik rekombination och gras gener 7.
Olika protokoll anrikningsteknik har använts för att generera ren fagisolat i Arthrobacter art. Tidiga förfaranden inkluderar inkubationer av jord med tillsats giftiga ämnen som nikotin salter för perioder på mer än ett år 8 ger upphov till fager kan endast infektera A. globiformis. Studier som gjorts med hjälp av jord percolated med labila organiska verkade producera detekterbara fager via plack analystekniker, utelämnar långa inkubationstid 8. Intressant dock, var en teknik som liknar direkt plätering använts tidigare gett upphov till flera fager samtidigt ha ett särskilt låg framgång av utredarna 5, citerar tidigare studier med låga svarsfrekvensen <supp> 8.
Sammantaget isoleringstekniker som används i det förflutna var noterbar för att ha lite effekt i praktiken trots Arthrobacter släktet representerar den vanligaste aeroba jord isolerar i naturen 4,9, Van Twest och Kropinski 10 nuvarande metoder anriknings för isolering fager från vatten och jord anpassat från tidigare tekniker som används för att berika miljön bakterieisolat men dessa anrikningsmetoder visat ineffektiva isolera Arthrobacter fager. Syftet med den metod som beskrivs här är att visa "proof of concept" att de tidiga metoderna anriknings kan anpassas till ett konsekvent och effektivt isolera Arthrobacter fager, vinna tidigare tekniska utmaningar som är förknippade med att isolera fager från denna bakterie släkte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots många tidigare försök att isolera fager som kan infektera Arthrobacter värdar, vi hade lite framgång med hjälp av standardprocedurer anriknings. Den gener metoden för bakteriell anrikning utvecklas och anpassas av van Twest och Kropinski 10 att berika fager från miljöprover fortfarande grunden för majoriteten av anriknings förfaranden. Bevis från tidigare studier tyder på att metoderna för direkta bordläggningen har producerat detekterbara plack på stammar av Arthrobacter</e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen av utvecklingen av detta protokoll lämnades av Southeastern Pennsylvania Consortium högskole- och Cabrini College Science Department. Ytterligare medel och stöd kom från Arcadia University och Immaculata University. Vi tackar särskilt Dr Karen Snetselaar vid St. Joseph University för vänligt ta elektronmikroskopiska bilder av våra isolerade fager. Ytterligare stöd kom från de Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Fag Hunters kunna främja Genomics och evolutionsvetenskap (SEA-fager) program.
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
Referências
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
