Medição de Extracelular Ion Fluxos Usando a técnica microeletrodos de auto-referência íon-seletivo

Summary

Os transportadores nas membranas celulares permitem a segregação diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas celulares e desempenham papéis cruciais durante a fisiologia, reparo e patologia dos tecidos. Descrevemos o microeletrodo de auto-referência íon-seletivo que permite a medição de fluxos de íons específicos em células e tecidos individuais in vivo.

Abstract

As células de animais, plantas e células individuais são envolvidas por uma barreira chamada a membrana celular que separa o citoplasma a partir do exterior. Camadas de células, tais como os epitélios também formam uma barreira que separa o interior a partir do exterior ou diferentes compartimentos de organismos multicelulares. Uma característica chave destas barreiras é a distribuição diferencial de íons através das membranas celulares ou camadas de células. Duas propriedades permitem que esta distribuição: 1) membranas e epitélios exibir permeabilidade seletiva de íons específicos; 2) são transportados através de bombas de iões através das membranas celulares e camadas de células. Estas propriedades desempenham um papel crucial na manutenção da fisiologia do tecido e agir como sinalização sinais de avaria, durante o reparo, ou sob condição patológica. A auto-referenciar microeléctrodo selectivo de iões permite medições de fluxos de iões específicos, tais como cálcio, potássio ou sódio em níveis de células e tecidos individuais. O microeléctrodo contém um ionóforo que é cocktailselectivamente permeável a um ião específico. A solução de enchimento interno contém um conjunto de concentração do íon de interesse. O potencial eléctrico do microeléctrodo é determinada pela concentração do ião exterior. À medida que a concentração de ião varia, o potencial do microeléctrodo muda como uma função do log da actividade de iões. Quando mudou-se para trás e perto de uma fonte ou sumidouro de íon (ou seja, em um gradiente de concentração devido ao fluxo de iões) o potencial flutua microeletrodos a uma amplitude proporcional ao fluxo de iões / gradiente. O amplificador amplifica o sinal de microeléctrodos e a produção é registada no computador. O fluxo de iões pode então ser calculado pela lei de Fick da difusão utilizando a flutuação potencial de eléctrodo, a excursão de microeléctrodo, e outros parâmetros, tais como a mobilidade de iões específica. Neste artigo, descreve em detalhes a metodologia para medir fluxos de iões extracelulares utilizando a auto-referência de microeletrodos um íon-seletivod apresentar alguns resultados representativos.

Introduction

Todas as células animais estão rodeados por uma membrana de bicamada lipídica que separa o citoplasma a partir do ambiente exterior. A célula mantém um potencial de membrana elétrica, negativa no interior, por transporte ativo de íons ^um. O potencial de membrana é uma fonte de energia que a célula pode utilizar para operar vários dispositivos moleculares na membrana ^2. Neurônios e outras células excitáveis ​​têm grandes potenciais de membrana. Rápida abertura dos canais de sódio recolhe o potencial de membrana (despolarização) e produz o potencial de acção que é transportado ao longo do comprimento do neurónio ^2. Aparte destas a....

Protocol

1. íon-seletivo de auto-referência microeletrodos Preparação

1. Preparação de microeléctrodos selectivo de iões
   1. Calor puxar finas capilares de borosilicato murados sem filamentos (diâmetro externo 1,5 milímetros, 1,12 mm de diâmetro interno), utilizando um extrator de microeletrodos.
      Nota: Isto dá dicas de 3-4 m de diâmetro. Dicas menores têm maior resistência que torna mais microeléctrodos sensíveis ao ruído electrónico e também está associada com uma resposta mais lenta para uma alteração na concentração de iões. Informações úteis pode ser encontrado no artigo publicado por Smith et ai. ^26.
   2. Silanizar os eletrodo....

Results

Temos anteriormente demonstrado que o influxo de cálcio aparece depois de uma única célula ferindo ^24. Nós, portanto, perguntado se outros fluxos de iões ocorrer após ferimento única célula. Utilizou-se o X. laevis oócito, um modelo bem estabelecido para única célula a cicatrização de feridas ^30-34 e gravação eletrofisiológico ^24,35-39. Curiosamente, íons de potássio são mais concentrados dentro X. oócitos laevis (cerca de 110 mM) de ⁴⁰ na solução ex.......

Discussion

Os passos mais críticos para a medição de fluxos de iões bem sucedida extracelulares in vivo são os seguintes: a redução do ruído, o fabrico correcto do micro-eléctrodos selectivos de iões e do eléctrodo de referência, e o posicionamento da amostra e ambos os eléctrodos.

A fim de minimizar o ruído, o sistema de gravação deve estar em uma ligação à terra (aterrada) gaiola de Faraday de preferência com um (isolamento de vibração) mesa com tampo de metal que também está ligado à terra........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IonAmp	Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA	nenhum	amplificador criado pelo Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA	nenhum	software criado pelo BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)
Pré-amplificador Headstage	Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, projetado pelo BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA	nenhum	três drivers MicroStep são necessários para o posicionamento X, Y e Z; criado pelo Centro de Pesquisa BioCurrents, Woods Hole, MA, EUA; Sistema semelhante pode ser adquirido de " A função XBL é importante" (http://www.xuyue.org/) ou de " YoungerUSA" (http://www.youngerusa.com/) ou da Eletrônica Aplicável(http://www.applicableelectronics.com/)
Microposicionador manual	Instrumentos de Precisão Mundiais	Modelo KITE-R	Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Suporte magnético	World Precision Instruments	Modelo M10	Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Tabela de isolamento de vibração	Newport Inc.	Modelo VW-3036-OPT-023040	Sistema semelhante pode ser adquirido na Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Parte de três microposicionadores dimensionais: suporte angular, 90°, faces ranhuradas	Newport Inc.	Modelo 360-90	A montagem dos três microposicionadores dimensionais requer também Três motores rotativos elétricos para controle X, Y, Z, braço de montagem MPH-1 com poste de ângulo ajustável MCA-2 e Vários conectores e parafusos Newport para aparafusar na mesa
de vibração Parte de três microposicionadores dimensionais: Estágio de Junção de Pinos 0,5 polegada X Travel	Newport Inc.	460PD-X	nenhum
Parte de três microposicionadores dimensionais: Estágio Linear de Montagem Rápida, 0,5 polegadas XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	nenhum
Kwik-Fil capilares de vidro borossilicato de parede fina sem filamento	Instrumentos de Precisão Mundiais	TW150-4	nenhum
Extrator de eletrodo	Narishige	PC-10	nenhum
Rack de metal	Feito internamente	nenhum	Suporte de eletrodo de metal feito internamente perfurando furos de 2 mm de largura meio centímetro espaçados em uma base retangular de aço de 10cm por 15cm
Forno	QL	Modelo 10 Forno	de laboratório nenhum
Solução de silanização I	Sigma-Aldrich	85126	Perigoso, manuseie conforme recomendado pelo provedor
Placa de Petri de vidro; Pyrex	Fisher Scientific	316060	nenhum
Frasco de armazenamento de eletrodo/micropipeta	World Precision Instruments	E215	nenhum
Dessecador de vidro	Fisher Scientific	08-595E	Contém dessecante de drierita (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, EUA). Coloque vaselina na vedação para torná-la hermética.
Pipeta de plástico Pasteur	Fisher Scientific	11597722	nenhum
Bico de Bunsen	Fisher Scientific	S97329	nenhum
Lâmina de microscópio	Sigma-Aldrich	S8902	nenhum
Suporte de microeletrodo reto	Warner Instruments	QSW-A15P	com um conector macho dourado de 1 mm e fio Ag/AgCl
Suporte de microeletrodo reto	World Precision Instruments	MEH3S	com um gêmulo AgCl(Ag+)interno e um conector macho dourado de 2 mm
Placa de Petri de 6 cm	VWR	60872-306	nenhuma
malha Nitex	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	nenhum
Cola; Epóxi Loctite	VWR	500043-451	Misture a cola e o endurecedor em partes iguais num recipiente de pesagem de plástico e misture bem. Endurece rapidamente, mas deixa em RT por 24 h para cura total
Água deionizada	Sigma-Aldrich	99053	nenhum
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S7653	nenhum
Cloreto	de Potássio Sigma-Aldrich	P9333	nenhum
Cloreto	de Cálcio Sigma-Aldrich	C1016	nenhum
Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	M8266	nenhum
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	nenhum
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S8045	nenhum
Acetato de potássio	Sigma-Aldrich	P1190	nenhum
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	nenhum