מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי
Summary
Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.
Abstract
תאים מבעלי חיים, צמחים ותאים בודדים מוקפים גדר נקראת קרום התא המפריד בין הציטופלסמה מבחוץ. שכבות תאים כגון epithelia גם יוצרות מחסום שמפריד בתוך מבחוץ או תאים שונים של יצורים רב-תאיים. תכונה מרכזית של חסמים אלה היא חלוקת ההפרש של יונים על פני קרום תא או שכבות תאים. שני נכסים לאפשר חלוקה זו: 1) קרומים וepithelia להציג חדירות סלקטיבית ליונים מסוימים; 2) יונים מועברים באמצעות משאבות פני קרום תא ותא שכבות. מאפיינים אלה ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הפיסיולוגיה רקמה ולפעול כאיתות רמזים לאחר נזק, במהלך תיקון, או תחת מצב פתולוגי. Microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיבי מאפשר מדידות של נתיבים ספציפיים של יונים כמו סידן, אשלגן או נתרן ברמות תא ורקמה אחת. Microelectrode מכיל קוקטייל ionophore שהואסלקטיבי חדיר ליונים מסוימים. פתרון המילוי הפנימי מכיל ריכוז קבוצה של היון של עניין. הפוטנציאל החשמלי של microelectrode נקבע על ידי הריכוז מחוץ ליון. כיון הריכוז משתנה, הפוטנציאל של microelectrode משתנה כפונקציה של היומן של פעילות היון. כשעברתי הלוך ושוב ליד מקור או כיור של היון (כלומר במפל ריכוזים בשל שטף יון) את פוטנציאל microelectrode נע במשרעת פרופורציונלית לשטף יון / השיפוע. המגבר מגביר את אות microelectrode והתפוקה נרשמה במחשב. שטף היון אז יכול להיות מחושב על ידי החוק של Fick של דיפוזיה באמצעות תנודות אלקטרודה פוטנציאליות, הטיול של microelectrode, ופרמטרים נוספים כגון ניידות היון הספציפית. במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה למדידה והנתיבים יון תאיים באמצעות microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיביd להציג כמה תוצאות נציג.
Introduction
כל התאים של בעלי החיים מוקפים בקרום bilayer שומנים שמפריד בין הציטופלסמה מהסביבה החיצונית. התא שומר על פוטנציאל הממברנה חשמל, שלילי בפנים, בתחבורה פעילה של יוני 1. פוטנציאל הממברנה הוא מקור אנרגיה אצור בו התא יכול לנצל להפעלת מכשירים מולקולריים שונים בקרום 2. יש נוירונים ותאים רגישים אחרים פוטנציאלי קרום גדולים. פתיחה מהירה של תעלות נתרן מתמוטטת הקרום פוטנציאלי (שלילת קוטביות) ומייצרת פוטנציאל הפעולה שמועבר לאורכו של נוירון 2. מלבד שינויים חשמליים מהירים אלה, רקמות ואיברים רבים ליצור ולשמור על פוטנציאל חשמלי לטווח ארוך משמעותי. לדוגמא, העור וepithelia קרני ליצור ולשמור על פוטנציאל טרנס-אפיתל וזרמים חשמליים תאיים על ידי שאיבה כיוונית של יונים (בעיקר נתרן כלורי ו) 3.
אוהל "> בעוד מדידות של זרם חשמלי תאי אנדוגני באמצעות הבדיקה הרוטטת 4-6 ומדידות של פוטנציאלי קרום או טרנס-אפיתל באמצעות מערכת microelectrode 7-10 לאפשר מדידה של הפרמטרים חשמליים של קרום תא ושכבות תאי אפיתל, שהם נותנים לא אינדיקציה למיני היון המעורב.Microelectrodes עם ionophore סלקטיבית יכולה למדוד ריכוז יון ספציפי בפתרון. מילויים יון או שטף ניתן היו למדוד עם שתיים או יותר אלקטרודות בעמדות שונות. עם זאת, להיסחף המתח הפנימי של כל בדיקה יהיה שונה, גורם למדידות מדויקות או אפילו גילוי של שיפוע שלא היה נוכח. אלקטרודה אחת השתמשה במצב "התייחסות עצמית" לפיו הוא נע בתדירות נמוכה בין שתי נקודות פותרת בעיה זו. עכשיו שטף היון שניתן לראות על הרקע להיסחף אות איטית יחסית ויציב (ראה איור 3). </p>
מערכת מדידת היון רגיש משתמשת microelectrodes התייחסות עצמית יון סלקטיבי כדי לזהות נתיבים תאיים קטנים של יונים קרובים לרקמות או תאים בודדים. המערכת מורכבת ממגבר שמעבד את האות מmicroelectrode ומנוע צעד מיקרו והנהג לשלוט בתנועה של microelectrode. Microelectrode יון סלקטיבי ואת האלקטרודה ההתייחסות שיסגור את המעגל מחוברים למגבר דרך headstage מראש מגבר (איור 1 א). תוכנת מחשב קובעת את הפרמטרים של תנועת microelectrode (תדירות, מרחק) וגם רושמת את התפוקה של המגבר. מנוע צעד שולט על תנועת microelectrode באמצעות micropositioner תלת-ממדי. תדירות נמוכה הרוטטת microelectrode יון סלקטיבי פותחה לראשונה בשנת 1990 למדידת שטף סידן ספציפי 11. כמו גם סידן, קוקטיילים ionophore מסחרי נגישים זמינים כעת לעשות MICRoelectrodes רגיש לנתרן, כלוריד, אשלגן, מימן, מגנזיום, ניטראט, אמוניום, פלואוריד, ליתיום או כספית.
בעיקרון, טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ממירה את הפעילות של יון ספציפי המומס בתמיסה לפוטנציאל חשמלי, הניתן למדידה על ידי מד מתח. קוקטייל ionophore הוא נוזל immiscible שלב (אורגני, lipophilic) עם תכונות החלפת יונים. Ionophore סלקטיבי קומפלקסים (נקשר) יונים ספציפיים הפיך ומעביר אותם בין התמיסה המימית הכלולות בmicroelectrode (אלקטרוליט) והתמיסה המימית שבי microelectrode הוא שקוע (1D איור). העברת יון זה מובילה לשיווי משקל אלקטרוכימיים ווריאציה של הפוטנציאל החשמלי בין microelectrode ואת האלקטרודה ההתייחסות נמדדת על ידי מד המתח. המתח הוא פרופורציונאלי ללוגריתם של פעילות היון הספציפית לפי דואר נרנסטquation מאפשר החישוב של ריכוז היון (איור 2 א 'וב').
נכון לעכשיו, כמה מערכות מאפשרות מדידה של שטף יון באמצעות מושג או עיקרון דומה. לדוגמא, טכניקת אלקטרודה סריקת יון סלקטיבי (סת) 12,13 או טכניקת microelectrode יון שטף הערכה (MIFE) שפותחה על ידי ניומן וShabala 14-16 הם זמינים מסחריים ושימוש נרחב על ידי קהילת המחקר כדי לקבוע יון ספציפי נתיבים המתרחשים בקרום תא ורקמה במגוון רחב של בעלי חיים, צמחים ודגמי תא חי בודדים. microelectrodes יון סלקטיבי כבר משמשת למדידת מימן, אשלגן וסידן על פני שטף שורשי צמח 17, שטף כלוריד בעורקי מוח חולדה 18 ובצינורות אבקה 19, שטף מימן בתאי רשתית להחליק 20, שטף סידן בעצמות עכבר 21, יון שונים נתיבים בפטריית העובש 22 ובrבקרנית 23, ובסופו שטף סידן במהלך פצע תא בודד ריפוי 12,24. ראה גם הסקירה לקבלת מידע מפורטת על microelectrodes התייחסות העצמית יון סלקטיבי 25 הבאה.
המאמר שלהלן מתאר בפירוט כיצד להכין ולבצע מדידה של נתיבי יון תאיים אנדוגני באמצעות טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ברמת התא הבודד.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר למדידת הצלחה של נתיבי יון תאיים in vivo הם: ההפחתה של הרעש, הייצור הנכון של האלקטרודה microelectrodes יון סלקטיבי וההתייחסות, והמיצוב של המדגם ושני אלקטרודות.
על מנת למזער את הרעש, מערכת ההקלטה צריכה להיות בכלוב פ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.
Materials
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
Referências
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
- Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
- Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
- Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
- McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
- Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
- Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. , 235-252 (1999).
- Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , 109-137 (2006).
- Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
- Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
- Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
- Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
- Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
- Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
- Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
- Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
- Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
- Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411 (2011).
- Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. H. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
- Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
- Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D., Momirović, K., Mildner, V. Ch. 48. Compstat. , 317-321 (1990).
- Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. . Graphical methods for data analysis. , (1983).
- Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
- Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
- Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
- Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
- Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
- Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
- Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. , 491-497 (1982).
- Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
- Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
- Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
- Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
- McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
- Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
- Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
- McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
- McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).
