Metode til måling af aktiviteten af afubiquitinerende Enzymer i cellelinier og vævsprøver
Summary
Den nuværende protokol detaljer en fremgangsmåde til måling af aktiviteten af funktionelt homologe afubiquitinerende enzymer. Specialiserede sonder kovalent modificere enzymet og give mulighed for detektion. Denne metode har potentiale til at identificere nye terapeutiske mål.
Abstract
Ubiquitin-proteasom systemet er for nylig blevet impliceret i forskellige patologier, herunder neurodegenerative sygdomme og cancer. I lyset af dette, teknikker til at studere den regulerende mekanisme af denne ordning er afgørende for at belyse de cellulære og molekylære processer i de førnævnte sygdomme. Brugen af hæmagglutinin afledt ubiquitin sonder er skitseret i dette dokument fungerer som et værdifuldt redskab for studiet af dette system. Dette papir beskriver en metode, der gør det muligt for brugeren at udføre assays, der giver en direkte visualisering af afubiquitinerende enzymaktivitet. Afubiquitinerende enzymer styrer proteasomalaktivitet nedbrydning og del funktionel homologi ved deres aktive steder, hvilket giver brugeren mulighed for at undersøge aktiviteten af flere enzymer i en assay. Lysater opnås gennem forsigtig mekanisk cellesprængning og inkuberet med aktiv stedrettet prober. Funktionelle enzymer er kodet med sonderne mens inaktive enzymer forbliver ubundet. Ved kørselning dette assay, at brugeren får oplysninger om både aktiviteten og potentielle ekspression af multiple afubiquitinerende enzymer på en hurtig og nem måde. Den nuværende metode er signifikant mere effektiv end anvendelse af individuelle antistoffer for de forudsagte hundrede afubiquitinerende enzymer i den humane celle.
Introduction
Ubiquitin-proteasom systemet (UPS) tjener som en af de store nedbrydningsveje i den mammale celle. Substrater vej til nedbrydning i proteasomet er kovalent mærket med polymerer af ubiquitin (Ub) 1. Før den målrettede substrat kommer ind i proteasom for nedbrydning, skal de poly-ubiquitin mærket fjernes. En klasse af enzymer kaldet afubiquitinerende enzymer (DUBs) er ansvarlig for fjernelse og genanvendelse af ubiquitin molekyler 2. Det er blevet forudsagt ud fra det humane genom, at der er næsten hundrede DUBs arbejder i cellen 3. Med sådan et stort antal DUBs kontrollerer Ub-medierede cellulære processer, studere disse enzymer er en udfordring, da mRNA teknikker ikke giver oplysninger om aktivitet og western blotting giver kun oplysninger om ekspressionsniveauer.
Anvendelsen af influenza hæmagglutinin (HA) mærkede, Ub-afledte aktive stedrettet prober muliggør en covalent modification af de funktionelle DUBs og derfor giver en direkte visualisering af aktiviteten af disse enzymer på en Western blot 4. Proberne har en C-terminal thiol reaktiv gruppe, der fungerer som et selvmord substrat for det aktive sted cysteinrest 5. Med disse prober, er det muligt at studere aktiviteten og potentielle ekspression af mange DUBs under både patologiske og fysiologiske tilstande af cellen.
Ændringer i DUB aktivitet, er blevet impliceret i en række patologiske tilstande, såsom Parkinsons, Alzheimers, anæmi og forskellige kræftformer 6-10. Denne teknik giver et stærkt værktøj til studiet af sygdom. I det foreliggende papir, viser vi anvendelsen af denne teknik i HeLa og M17-celler, der er blevet lyseret anvendelse af glasperler. Desuden har vi skitsere, hvordan at bruge denne metode i muse rygmarv vævsprøver. Oplysningerne fra denne teknik kan anvendes som et udgangspunkt for at identificereterapeutiske mål samt fastlæggelse modeller til undersøgelse af forskellige sygdomstilstande. Den sande nytte af denne teknik ligger i dens evne til at give oplysninger om flere DUBs i en enkelt analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da ubiquitinering er en grundlæggende cellulær aktivitet, kunne forstå de reguleringsmekanismer være nøglen til unearthing processerne på sygdom og patologi. Brugen af HA mærkede Ub-afledte aktive stedrettet sonder rapporteret her giver en let, men yderst anvendelig metode til undersøgelse Ub-medieret proteinnedbrydning. Denne metode er hurtigere og billigere end at studere hver enkelt af de DUBs individuelt.
I denne fremgangsmåde bliver lysis af cellerne opnås via mekaniske …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Lee lab fra University of Minnesota for at give musen rygmarven vævsprøver, der blev brugt. Dette arbejde blev støttet af det amerikanske forsvarsministerium i æggestokkene Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, som Randy Shaver Cancer Research og Fællesskabets fond til MB og af Minnesota kræft i æggestokkene Alliance (MOCA) til MB. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Referências
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
