Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben
Summary
Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.
Abstract
Das Ubiquitin-Proteasom-System wurde vor kurzem in verschiedenen Pathologien einschließlich neurodegenerativen Krankheiten und Krebs in Verbindung gebracht. In diesem Licht sind, Verfahren für die Untersuchung der Regulationsmechanismus des Systems wesentlich, die Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse der zuvor genannten Erkrankungen. Die Verwendung von Hämagglutinin abgeleitet Ubiquitin Sonden vorliegenden Ausführungen dient als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Systems. Dieses Papier Details eines Verfahrens, das dem Benutzer ermöglicht, Tests, die eine direkte Visualisierung der deubiquitinierenden Enzymaktivität geben, durchzuführen. Deubiquitinierungsenzyme steuern proteasomalen Abbau und teilen funktionelle Homologie in ihren aktiven Zentren, die es dem Benutzer, um die Aktivität mehrerer Enzyme in einem Test untersucht werden können. Lysate werden durch sanfte mechanische Zellaufschluss erhalten und mit der aktiven Stelle gerichtet Sonden inkubiert. Functional Enzyme werden mit den Sonden markiert, während inaktiver Enzyme ungebunden bleiben. Durch Laufning dieser Test erhält der Benutzer Informationen sowohl über die Aktivität und möglichen Expression mehrerer Deubiquitinierungsenzyme in einer schnellen und einfachen Weise. Das gegenwärtige Verfahren ist wesentlich effizienter als die Verwendung von einzelnen Antikörper für die vorhergesagten hundert Deubiquitinierungsenzyme in der menschlichen Zelle.
Introduction
Der Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) als eine der wichtigsten Abbauwege in der Säugerzelle ist. Substrate für den Abbau im Proteasom gebunden sind kovalent mit Polymeren von Ubiquitin (Ub) 1 markiert. Bevor die gezielte Substrat das Proteasom für den Abbau eintritt, muss der Poly-Ubiquitin-Tag entfernt werden. Eine Klasse von Enzymen als Deubiquitinierungsenzyme (DUBs) bekannt ist, ist für die Beseitigung und Verwertung von Ubiquitin-Moleküle 2 verantwortlich. Es wurde aus dem menschlichen Genom vorhergesagt, dass es fast hundert DUBs arbeiten in der Zelle 3. Mit solch einer großen Anzahl von DUBs Steuerung Ub-vermittelte zelluläre Prozesse, das Studium dieser Enzyme ist eine Herausforderung, da mRNA Techniken nicht geben Auskunft über Aktivität und Western-Blot nur gibt Informationen über die Expressionsniveaus.
Die Verwendung von Influenza-Hämagglutinin (HA) versehen, Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden ermöglicht eine kovalente modifizierung der funktionellen DUBs und deshalb ergibt eine direkte Visualisierung der Aktivität dieser Enzyme auf einem Western-Blot-4. Die Sonden haben eine C-terminalen Thiol reaktionsfähigen Gruppe, die als Suizid-Substrat für das aktive Zentrum Cysteinrest 5 dient. Bei diesen Sonden ist es möglich, die Aktivität und möglichen Expression vieler DUBs unter beiden pathologischen und physiologischen Zuständen der Zelle zu untersuchen.
Änderungen DUB Aktivität wurden in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Parkinson, Alzheimer, Anämie und verschiedene Krebs 6-10 gebracht. Diese Technik bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung von Krankheiten. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Anwendung dieser Technik in HeLa und M17-Zellen unter Verwendung von Glasperlen, die aufgeschlossen haben. Zusätzlich beschreiben wir, wie man diese Methode in der Maus Rückenmark Gewebeproben zu verwenden. Die von dieser Technik erhaltenen Informationen können als Ausgangspunkt für die Identifizierung verwendet werdentherapeutische Ziele sowie die Schaffung Modelle für die Untersuchung von verschiedenen Krankheitszuständen. Der wahre Nutzen dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, Informationen zu mehreren DUBs in einem einzigen Assay bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seit Ubiquitinierung ist eine grundlegende zelluläre Aktivität, könnte das Verständnis der Regulationsmechanismen der Schlüssel, um auszugraben die Prozesse der Krankheit und Pathologie. Die Verwendung von HA getaggt Ub abgeleitete aktive Zentrum gerichteten Sonden hier berichteten bietet eine einfache, aber sehr zutreffend Methode zur Untersuchung Ub-vermittelten Proteinabbau. Dieses Verfahren ist schneller und weniger kostspielig als das Studium jedes der DUBs einzeln.
In diesem Verfa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Lee-Labor der Universität von Minnesota für die Bereitstellung der Maus Rückenmark Gewebeproben, die verwendet wurden bedanken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 auf MB, die von den Randy Shaver Cancer Research und Gemeinschaftsfonds zur MB und die Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) bis MB. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder zu Erstellung des Manuskripts.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Referências
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