שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.
Abstract
לאחרונה מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום הייתה מעורבת בפתולוגיות שונות כולל מחלות ניווניות וסרטן. לאור זאת, טכניקות ללימוד מנגנון הרגולציה של מערכת זו הן חיוניות להבהרת התהליכים התאיים ומולקולריים של המחלות הנ"ל. השימוש בבדיקות היוביקוויטין hemagglutinin נגזר המתוארות במאמר זה משמש ככלי רב ערך למחקר של מערכת זו. מאמר זה מפרט שיטה המאפשרת למשתמש לבצע מבחני שנותנים להדמיה ישירה של deubiquitinating פעילות אנזים. אנזימי Deubiquitinating לשלוט השפלה proteasomal ולשתף הומולוגיה פונקציונלית באתרים הפעילים שלהם, המאפשר למשתמש לחקור את הפעילות של אנזימים רבים בassay אחד. מתקבל lysates דרך הפרעה תא מכאנית עדינה וטופחו עם בדיקות מכוונות אתר פעיל. אנזימים פונקציונליים מתויגים עם הבדיקות תוך אנזימים פעילים יישארו מאוגד. על ידי הפעלהנינג assay זה, המשתמש מקבל את המידע משני הפעילות וביטוי פוטנציאל של אנזימי deubiquitinating מרובים באופן מהיר וקל. השיטה הנוכחית היא באופן משמעותי יעילה יותר באמצעות נוגדני פרט למאה האנזימים deubiquitinating חזו בתא האנושי.
Introduction
מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) משמשת כאחד ממסלולי השפלה המרכזיים בתא היונקים. מצעים מחויבים לפירוק בפרוטאזום מתויגים קוולנטית עם פולימרים של היוביקוויטין (UB) 1. לפני המצע הממוקד נכנס לפרוטאזום לשפלה, יש להסיר את תג פולי-יוביקוויטין. כיתה של אנזימים המכונים deubiquitinating אנזימים (dubs) אחראית לפינוי והמיחזור של מולקולות יוביקוויטין 2. זה כבר חזה מהגנום האנושי שיש כמעט מאה ממכן עובד בתא 3. עם מספר כה גדול של ממכן שליטה תהליכים תאיים בתיווך UB, לומד אנזימים אלה מציב אתגר מאז טכניקות mRNA לא נותנים מידע על פעילות ומערבית סופג רק נותן מידע על רמות ביטוי.
השימוש בhemagglutinin השפעת (HA) מתויג, UB-נגזר בדיקות אתר מכוונות פעילים מאפשר לmod קוולנטייםification של ממכן הפונקציונלי ולכן נותן להדמיה ישירה של הפעילות של אנזימים אלה על כתם מערבי 4. יש בדיקות קבוצה תגובתי תיאול C-מסוף המשמשת כמצע להתאבדות שאריות ציסטאין אתר הפעיל 5. עם בדיקות אלה, ניתן ללמוד את הפעילות וביטוי פוטנציאל של ממכן רבים תחת שני מצבים פתולוגיים ופיסיולוגיים של התא.
שינויים בפעילות DUB היו מעורבים במגוון של מצבים פתולוגיים כגון פרקינסון, אלצהיימר, אנמיה וסוגי סרטן שונים 6-10. טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר המחלה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים את היישום של טכניקה זו בתאי הלה וM17 שכבר lysed באמצעות חרוזים זכוכית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בשיטה זו בדגימות רקמת חוט השדרה עכבר. המידע שהתקבל מטכניקה זו יכול לשמש כנקודת פתיחה לזיהוימטרות טיפוליות, כמו גם דגמי ההקמה לחקר תנאי מחלה שונים. השירות האמיתי של טכניקה זו הוא ביכולתה לספק מידע על ממכן מרובה בassay אחד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז ubiquitination היא פעילות סלולרית בסיסית, הבנת מנגנוני הרגולציה יכולה להיות המפתח לחושף את תהליכי המחלה ופתולוגיה. השימוש בHA מתויג בדיקות אתר מכוונות פעילים נגזרות UB דיווחו כאן מספקת שיטה קלה, אבל זה אפשרי מאוד ללימוד פירוק חלבונים בתיווך UB. שיטה זו היא מהירה יותר וזול ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למעבדה שלי באוניברסיטת מינסוטה למתן דגימות רקמת חוט השדרה העכבר שהיו בשימוש. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לתכנית ביטחון סרטן השחלות מחקר (OCRP) OC093424 לMB, על ידי חקר הסרטן וקהילה קרן רנדי מכונת גילוח לMB ועל ידי השחלות ברית סרטן מינסוטה (MOCA) לMB. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Referências
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
