सेल लाइनों और ऊतकों के नमूनों में Deubiquitinating एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए विधि
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कार्यात्मक मुताबिक़ deubiquitinating एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए एक विधि का विवरण है। विशेष जांच covalently एंजाइम को संशोधित करने और पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। इस विधि को नई चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने की क्षमता रखती है।
Abstract
ubiquitin-Proteasome प्रणाली हाल ही में neurodegenerative रोगों और कैंसर सहित विभिन्न विकृतियों में फंसा दिया गया है। इस के प्रकाश में, इस प्रणाली के नियामक तंत्र के अध्ययन के लिए तकनीक के aforementioned रोगों के सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं elucidating के लिए आवश्यक हैं। इस पत्र में उल्लिखित hemagglutinin व्युत्पन्न ubiquitin जांच के उपयोग के लिए इस प्रणाली के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है। इस पत्र में एंजाइम गतिविधि deubiquitinating के प्रत्यक्ष दृश्य दे कि assays के प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है एक विधि का विवरण है। Deubiquitinating एंजाइमों proteasomal गिरावट को नियंत्रित करने और उपयोगकर्ता एक परख में कई एंजाइमों की गतिविधि की जांच करने की अनुमति देता है जो उनके सक्रिय साइटों, पर कार्यात्मक अनुरूपता साझा करें। Lysates कोमल यांत्रिक सेल व्यवधान के माध्यम से प्राप्त की है और सक्रिय साइट निर्देशित जांच के साथ incubated हैं। निष्क्रिय एंजाइमों अपार रहते हैं, जबकि कार्यात्मक एंजाइमों जांच के साथ टैग कर रहे हैं। रननिंग इस परख, उपयोगकर्ता गतिविधि और एक तेज और आसान तरीके से कई deubiquitinating एंजाइमों के संभावित अभिव्यक्ति दोनों के बारे में जानकारी प्राप्त करता है। वर्तमान पद्धति मानव कोशिका में भविष्यवाणी की एक सौ deubiquitinating एंजाइमों के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग की तुलना में काफी अधिक कुशल है।
Introduction
ubiquitin-Proteasome प्रणाली (यूपीएस) स्तनधारी सेल में प्रमुख गिरावट रास्ते में से एक के रूप में कार्य करता है। Proteasome में गिरावट के लिए बाध्य Substrates covalently ubiquitin (यूबी) 1 के पॉलिमर के साथ टैग कर रहे हैं। लक्षित सब्सट्रेट गिरावट के लिए Proteasome में प्रवेश से पूर्व, पाली ubiquitin टैग हटा दिया जाना चाहिए। एंजाइमों (बताती है) deubiquitinating रूप में जाना जाता एंजाइमों का एक वर्ग ubiquitin अणुओं 2 के हटाने और रीसाइक्लिंग के लिए जिम्मेदार है। यह सेल 3 में काम कर रहे लगभग एक सौ बताती हैं कि वहाँ मानव जीनोम से भविष्यवाणी की गई है। UB-मध्यस्थता सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने बताती है की इतनी बड़ी संख्या के साथ इन एंजाइमों का अध्ययन केवल अभिव्यक्ति के स्तर के बारे में जानकारी देता है mRNA के तकनीक गतिविधि और पश्चिमी सोख्ता के बारे में जानकारी देने के लिए नहीं करते हैं क्योंकि एक चुनौती प्रस्तुत करता है।
इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (हेक्टेयर) का उपयोग एक सहसंयोजक आधुनिक विपणन के लिए अनुमति देता सक्रिय साइट निर्देशित जांच UB-व्युत्पन्न, टैग कियाकार्यात्मक बताती है और इसलिए की ification एक पश्चिमी धब्बा 4 पर इन एंजाइमों की गतिविधि का एक प्रत्यक्ष दृश्य देता है। जांच सक्रिय साइट सिस्टीन अवशेषों 5 के लिए एक आत्मघाती सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है कि एक सी टर्मिनल thiol प्रतिक्रियाशील समूह है। इन जांच के साथ, यह सेल के दोनों रोग और शारीरिक राज्यों के तहत कई बताती है की गतिविधि और संभावित अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए संभव है।
डब गतिविधि में परिवर्तन ऐसे पार्किंसंस, अल्जाइमर, एनीमिया और विभिन्न प्रकार के कैंसर 6-10 के रूप में रोग की स्थिति की एक श्रेणी में शामिल किया गया है। इस तकनीक को बीमारी के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। वर्तमान पत्र में, हम ग्लास मनकों का उपयोग lysed किया गया है कि HeLa और M17 कोशिकाओं में इस तकनीक के आवेदन दिखा। इसके अतिरिक्त, हम माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के नमूनों में इस विधि का उपयोग करने के लिए कैसे रूपरेखा। इस तकनीक से प्राप्त जानकारी की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैचिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिन्न रोग की स्थिति के अध्ययन के लिए की स्थापना मॉडल। इस तकनीक का सच उपयोगिता एक भी परख में कई बताती है के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitination एक मौलिक सेलुलर गतिविधि है, विनियामक तंत्र को समझने की बीमारी और विकृति की प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। हा का उपयोग यहां बताया UB-व्युत्पन्न सक्रिय साइट निर्देशित जांच U…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस्तेमाल किया गया है कि माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के नमूनों प्रदान करने के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय के ली प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम MB करने के लिए रैंडी शेवर कैंसर रिसर्च और सामुदायिक कोष से और मिनेसोटा डिम्बग्रंथि के कैंसर गठबंधन (MOCA) MB करने के द्वारा, रक्षा डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (ओसीआरपी) MB करने के लिए OC093424 विभाग द्वारा समर्थित किया गया। funders के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Referências
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
