Metode for måling av aktiviteten til Deubiquitinating Enzymer i cellelinjer og vevsprøver
Summary
Den nåværende protokoll detaljer en metode for å måle aktiviteten av funksjonelt homologe deubiquitinating enzymer. Specialized sonder kovalent endre enzymet og gir mulighet for deteksjon. Denne metoden har potensiale for å identifisere nye terapeutiske mål.
Abstract
Den ubiquitin-proteasom-system er nylig blitt implisert i forskjellige sykdomstilstander, inkludert neurodegenerative sykdommer og kreft. I lys av dette, teknikker for å studere reguleringsmekanisme av dette systemet er avgjørende for å belyse de cellulære og molekylære prosesser i de nevnte sykdommene. Bruken av hemaglutinin avledet ubiquitin-prober som er beskrevet i dette papir tjener som et verdifullt verktøy for studium av dette systemet. Dette papiret detaljer en metode som gjør det mulig for brukeren å utføre analyser som gir en direkte visualisering av deubiquitinating enzymaktivitet. Deubiquitinating enzymer kontrollere proteasomal fornedrelse og dele funksjonelle homologi på sine aktive nettsteder, som gjør det mulig for brukeren å undersøke aktiviteten til flere enzymer i én analyse. Lysater oppnås gjennom milde mekanisk celle avbrudd og inkuberes med aktiv setestyrte sonder. Funksjonelle enzymer er merket med sondene mens inaktive enzymer forbli ubundet. Ved å kjørening av denne analysen, får brukeren informasjon om både aktiviteten og potensialet ekspresjon av flere deubiquitinating enzymer på en rask og enkel måte. Den nåværende metode er vesentlig mer effektiv enn å bruke individuelle antistoffer for de forutsagte hundre deubiquitinating enzymer i den humane celle.
Introduction
Den ubiquitin-proteasom system (UPS) fungerer som en av de viktigste nedbrytningsmekanismer i pattedyrcelle. Underlag bundet for nedbrytning i proteasome er kovalent merket med polymerer av ubiquitin (Ub) 1. Før den måls substratet kommer inn i proteasome for nedbrytning, må poly-ubiquitin merkelappen fjernes. En klasse av enzymer som kalles deubiquitinating enzymer (Dubs) er ansvarlig for fjerning og gjenvinning av ubiquitin molekyler to. Det har blitt spådd fra det menneskelige genom at det er nesten hundre Dubs arbeider i cellen tre. Med et så stort antall Dubs kontrollerende Ub-mediert cellulære prosesser, studerer disse enzymene presenterer en utfordring siden mRNA teknikker ikke gir informasjon om aktivitet og western blotting bare gir informasjon om uttrykket nivåer.
Bruken av influensa hemagglutinin (HA) merket, Ub-avledet aktive sete-rettet sonder gjør det mulig for en kovalent modreduser fuktighet av de funksjonelle Dubs og derfor gir en direkte visualisering av aktiviteten til disse enzymene på en Western blot-4. Sondene har en C-terminal tiol-reaktiv gruppe som fungerer som et substrat for selvmord det aktive sete cystein-rest 5. Med disse sonder, er det mulig å studere aktiviteten og potensialet ekspresjon av mange Dubs under begge patologiske og fysiologiske tilstander av cellen.
Endringer i DUB-aktivitet har vært implisert i en rekke patologiske tilstander, slik som Parkinsons, Alzheimers, anemi og ulike kreftformer 6-10. Denne teknikken gir et kraftig verktøy for studier av sykdommen. I det foreliggende papir, viser vi anvendelsen av denne teknikk i HeLa og M17-celler som er lysert ved hjelp av glassperler. I tillegg vi skissere hvordan du bruker denne metoden i museryggmargs vevsprøver. Informasjon fra denne teknikken kan brukes som et utgangspunkt for identifiseringterapeutiske mål samt etablere modeller for studiet av ulike sykdomstilstander. Den sanne nytten av denne teknikken ligger i dens evne til å gi informasjon om flere Dubs i en enkelt analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siden ubiquitinering er en grunnleggende celleaktivitet, kunne forstå de regulatoriske mekanismer være nøkkelen til å undergrave prosesser av sykdom og patologi. Bruken av HA tagget Ub-avledet aktive site rettet sonder som presenteres her gir en enkel, men svært anvendelig metode for å studere Ub-mediert protein degradering. Denne metoden er raskere og mindre kostbar enn å studere hver og en av de Dubs individuelt.
I denne metoden, blir lysering av cellene oppnås via mekaniske midler…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Lee laboratoriet ved Universitetet i Minnesota for å gi musen ryggmargs vevsprøver som ble brukt. Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, med Randy Shaver Cancer Research and Community Fund til MB og ved Minnesota Eggstokkreft Alliance (MOCA) til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
Referências
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
