Aqui demonstramos os métodos mais eficientes para congelamento, incorporação, criossecção e coloração de biópsias musculares para evitar o congelamento de artefatos.
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Artigo de método
Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.
Introdução
O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração.
Os tecidos podem ser preparados ....
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Protocolo
1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares
- Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano.
- Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.
- Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5.
- Cuidadosamente separar o músculo de int....
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Resultados
A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de isopentano apr.......
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Discussão
A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a novas medidas p.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Alex Miller pelas revisões do manuscrito. Este trabalho foi apoiado com as bolsas de pesquisa concedidas a M.G. da Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) e Muscular Dystrophy Association (218938).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Criostato | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 EUA, telefone comercial 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific |
| Microscópio | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus |
| Software de análise de imagem | Nikon Imaging Software Pesquisa Básica | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativas: Imagem J, Metamorph |
| Isoflurano | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 EUA |
| OUTUBRO | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Fonte alternativa: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR |
| Scientific Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
Referências
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 ....
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Reimpressões e permissões
