RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.
mRNA er ofte lokalisert til virveldyr axoner og deres lokale oversettelse er nødvendig for axon pathfinding eller forgrening under utvikling og for vedlikehold, reparasjon eller neurodegenerering i postdevelopmental perioder. Høye throughput analyser har nylig avdekket at axons har en mer dynamisk og kompleks transkriptom enn tidligere antatt. Disse analyse, men har stort sett gjort i dyrkede nerveceller der axoner kan isoleres fra somato-dendrittiske avdelinger. Det er praktisk talt umulig å oppnå en slik isolasjon i hele vev in vivo. Således, for å verifisere at rekruttering av mRNA og deres funksjonelle relevans i et helt dyr, transkriptom analyser bør ideelt sett være kombinert med teknikker som tillater visualisering av mRNA in situ. Nylig har nye ISH teknologi som gjenkjenner RNA på en enkelt-molekyl nivå blitt utviklet. Dette er spesielt viktig når analysere den subcellulære lokalisering av mRNASiden lokaliserte RNA finnes vanligvis på lave nivåer. Her beskriver vi to protokoller for påvisning av axonally-lokaliserte mRNA ved hjelp av en ny ultra RNA ISH teknologi. Vi har kombinert RNAscope ISH med axonal counterstain med fluoresens immunhistokjemi eller histologiske fargestoffer for å verifisere rekruttering av Atf4 mRNA til axoner in vivo i moden mus og menneskehjerner.
Axonal mRNA rekruttering og lokal oversettelse aktivere axoner å svare på ekstracellulære stimuli i en tid og rom akutt måte en. Intra-axonal proteinsyntesen er best forstås i sammenheng med neurodevelopment der den spiller avgjørende roller i vekst kjegle oppførsel 2-8, axon pathfinding 9-11 og retrograd signale 12,13. Men langt mindre er kjent om den funksjonelle betydningen av aksonal proteinsyntese i post-utviklings nevroner når aksonale mRNA og ribosom nivåer er sterkt redusert 14,15. Modne virveldyr aksoner har lenge vært antatt å være translasjonelt inaktiv 16. Men nyere studier tyder på at lokale oversettelses reaktiveres i modne aksoner etter patologiske tilstander. For eksempel, er en undergruppe av mRNA rekruttert til regenererende axoner etter nerveskade og intra-aksonal proteinsyntese er nødvendig for riktig regenerering av disse 17 aksoner. I tillegg vår gruppe has demonstrert at spesifikke mRNA blir rekruttert til axoner etter lokal eksponering for Alzheimers sykdom peptid Ap 1-42, og lokale oversettelse av transkripsjonsfaktoren ATF4 er nødvendig for å forplante nevrodegenerative effekter av Ap 1-42 fra axoner til nevronale soma 18. Endelig har høy gjennomstrømning analyser viste at modne aksoner har en mer kompleks og dynamisk transcriptome enn forventet 18-21, spesielt under patologiske tilstander. I lys av disse studiene, for en meget følsom og spesifikk metode detektere axonally lokaliserte mRNA i voksent nervesystemet er nødvendig.
Mye av arbeidet på mRNA rekruttering og lokal oversettelse i modne aksoner har blitt utført på dyrkede nerveceller. Dette gjelder særlig for transcriptome analyser siden spesialiserte dyrkningsmetoder finnes som tillater isolering av axoner fra somato-dendrittiske rommet 18-20. Selv om slike studier har gitt verdifulle insight inn i rollen som lokal oversettelse i modne aksoner, spørsmålet om dyrkede nerveceller representerer trofast situasjonen in vivo eller hvis mRNA rekruttering er en adaptiv respons av aksoner til dyrking forholdene er fortsatt åpen. Få studier har gitt holdepunkter for mRNA rekruttering til modne axoner in vivo. For eksempel har den transkripsjon koding for lukte markør protein er påvist i axoner i voksen sensoriske nevroner 22. En transgen inneholder 3 'UTR av β-aktin mRNA transporteres til axoner i perifere og sentrale nervesystemet nerveceller i mus og er lokalt oversatt etter utviklings perioder 23. Lamin b2 mRNA er lokalisert til retinal axoner i Xenopues laevis rumpetroll og dens uttømming påvirker axon vedlikehold etter aksonal utvikling 21. Interferens med aksonal transport av mRNA som koder for cytokrom C oksidase IV endrer muse atferd 24. Til slutt blir Atf4 mRNA finnes i en voksenXON av mus og menneskehjerner i sammenheng med Ap 1-42 -indusert neurodegenerering 18.
Høy gjennomstrømning transkriptom analyser har vist seg å være nyttig for å identifisere mRNA profiler i isolerte aksoner in vitro, men har begrensninger for in vivo-studier siden i hele vev aksoner finnes aldri i isolasjon, men blandet med neuronal cellelegemer, gliale celler og andre celletyper. Således kan slike analyser har til å bli kombinert med bildeteknikker som bekrefter den subcellulære lokalisering av mRNA. RNA in situ hybridisering (RNA ISH) tillater påvisning og visualisering av spesifikke RNA-sekvenser i celler og vev. Men opprinnelige RNA ISH analyser var kun egnet for identifisering av svært rike RNA 25, noe som er sjelden tilfelle for axonally lokaliserte mRNA. For de siste tiårene økende innsats har blitt satt i å utvikle nye teknologier som tillater påvisning av mRNA på enkelt-molekyl nivå <sup> 25,26. For eksempel, Singer og kolleger har utviklet ISH sonder for å oppdage mRNAs i enkeltceller, som består i fem ikke-overlapp fluoresceinmerket 50-merer (for detaljer, se 27). Den største forskjellen mellom de ovennevnte teknikker og den ene her er beskrevet, er at den senere bruker 20 double Z-struktur (ikke lineær) sonder som vanligvis er rettet mot ~ 1 kb region av RNA av interesse å sikre spesifisitet og lav bakgrunnsnivåer. Prober blir deretter hybridisert med forforsterker og forsterkersekvenser som er endelig fluorescensmerkede eller konjugert med enzymer som gjør kromogene reaksjoner. Disse forsterkertrinn forbedre signal-til-støy-forhold i forhold til andre teknologier 28 ISH. Her beskriver vi to protokoller som bruker RNAscope kombineres enten med fluorescens immunocytochemistry eller med histologiske fargestoffer slik aksonal kontra. Begge protokollene er egnet til å visualisere aksonal lokalisering av Atf4 mRNA i voksen mobruke og menneskehjerner.
I denne rapporten beskriver vi bruk av en høy oppløsning ISH teknologi i deteksjon av axonally lokalisert Atf4 mRNA. Disse og tidligere publiserte studier viser at denne teknologien er kompatibel med antistoff-baserte protein påvisning i vev eller hele embryoer 33. Viktigere, har det nylig blitt brukt for påvisning av Arc mRNA innen dendritter av hippocampus nevroner 34. Den kan også kombineres med histologiske fargestoffer for vev-farging. Til slutt, er det egnet for samtidi…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Alzheimer’s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer’s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions
custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2) | Advanced Cell Diagnostics | – | probe |
negative control probe-DapB | Advanced Cell Diagnostics | 310043 | probe |
positive control probe-mouse Polr2A (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 312471 | probe |
positive control probe-human PPIB (optional) | Advanced Cell Diagnostics | 313901 | probe |
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection) | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | In situ hybridization kit |
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit – BROWN (for chromogenic detection) | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | In situ hybridization kit |
Goat polyclonal anti-ChAT antibody | Millipore | AB144P | |
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit | American MasterTech | KTLFB | |
Clearify clearing agent (xylene substitute) | American MasterTech | CACLEGAL | |
ProLong Gold mounting medium with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
DPX mounting medium | Sigma | 6522 |