In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
Synthetische Materialien sind dafür bekannt, klinischen Komplikationen wie Entzündungen, Stenose und Infektionen auslösen, wenn sie als Gefäßersatz implantiert. Collagen wurde ausgiebig für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen aufgrund seiner inhärenten Biokompatibilität verwendet und wird als eine Alternative zu synthetischen Materialien (dh geringe Antigenität, Entzündung und cytotoxischen Antworten). Allerdings haben die begrenzten mechanischen Eigenschaften und die damit verbundene niedrige Hand-Fähigkeit Kollagengelen ihre Verwendung als Gerüstmaterial für die vaskuläre Gewebezüchtung behindert. Daher ist die Logik hinter dieser Arbeit wurde zum ersten Mal cellularized Kollagengelen in eine rohrförmige Geometrie und zweite Ingenieur glatten Muskelzellen verbessern angetrieben Reorganisation der Kollagenmatrix, um Gewebe steif genug, um gehandhabt werden zu erhalten.
Die hier beschriebene Strategie beruht auf der direkten Montage von Kollagen und glatten Muskelzellen (Konstrukt) in einem 3D cyli basierendndrical Geometrie mit der Verwendung einer Formtechnik. Dieses Verfahren erfordert eine Reifezeit, während der die Konstrukte sind in einem Bioreaktor unter statischen Bedingungen kultiviert (ohne angewendete äußere Dynamik mechanischer Druck) für 1 oder 2 Wochen. Die "statische Bioreaktor" bietet eine Überwachung und Steuerung sterile Umgebung (pH, Temperatur, Gasaustausch, Nährstoffversorgung und Entsorgung), um den Konstrukten. Während der Kulturperiode wurden Dickemessungen durchgeführt, um die Zellen getriebenen Remodellierung der Kollagenmatrix zu bewerten, und Glukoseverbrauch und Lactatproduktion Raten wurden gemessen, um die Zellen zu überwachen metabolischen Aktivität. Schließlich wurden die mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften für die resultierenden röhrenförmigen Konstrukte bewertet. Hierzu spezifischen Protokollen und einer fokussierten Know-how (Manipulation, Greifen, die in hydratisierter Umgebung usw.) wurden entwickelt, um die das erzeugte Gewebe zu charakterisieren.
Gefäßgewebetechnik sieht verschiedene Strategien bei der Herstellung von technischen Fahrzeuge, einschließlich Transplantaten auf Basis synthetischer Gerüste Zellage basierte Gewebezüchtung Blutgefäße (TEBVs) und extrazelluläre Matrix (ECM) Zielkomponenten basierende TEBVs. Unter diesen Ansätzen, synthetische Polymere gute mechanische Eigenschaften, aber einen gemeinsamen Nachteil, da sie keine Bioaktivität 1. Die Zellschicht basierenden Verfahren ermöglicht die Herstellung von technisch Gefäßersatz mit hohen mechanischen Eigenschaften, aber die erforderliche Zeit, um solche Transplantate herzustellen ist ungefähr 28 2 Wochen. Natürliche Biopolymere des ECM, wie Kollagen, Elastin, Fibrin 3 oder einer Kombination davon, bleiben die Goldstandardmaterialien für das Tissue Engineering Scaffolds. Dies ist vor allem aus dem Grund, dass diese Materialien besitzen im allgemeinen eine gute Biokompatibilität während in der Lage, um funktionelle zelluläre Reaktionen 4-5 induzieren. Unter diesen Biopolymers, Kollagen Typ I ist eine der häufigsten und vorherrschende tragende Protein der ECM in vielen Geweben wie Haut, Blutgefäße und Sehnen. Umfangreiche Arbeiten wurden auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagen 6 durchgeführt worden – 8, aber es wurden nur wenige Untersuchungen über zelluläre Umbildung Kollagengele bei statischer Reifung. Cellular Remodeling bezieht sich auf die strukturelle Modifikationen der Kollagenmatrix durch Zellen, die die Stabilität des Kollagen-Fibrillen-Netzwerk 9 beeinflussen könnten induziert. Als natürliches Gerüst können relativ große Mengen an Kollagen Typ I isoliert, sterilisiert und aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Ratten-Schwanzsehnen 10 gespeichert. Verständnis zellulärer Wechselwirkungen mit Kollagen und die zugehörigen mechanischen Gesamtverhalten der cellularized Kollagenträger (Konstrukte) ist ein wesentlicher Schritt für den Aufbau von Gewebe. Kollagenbasis TEBVs kann durch direktes Mischen Zellen mit Kollagen verarbeitet werdenwährend Gelzubereitung und weiter in spezifische Formen wie rohrförmig und planar 11 geformt. Gefäßzellen in den Gelen vermehren und umgestalten Kollagen Typ I 12. Somit diese Methode umgeht die Notwendigkeit einer besonderen Makroporosität, die eine der wesentlichen Probleme bei der Entwicklung von Scaffolds für das Tissue Engineering-Anwendungen darstellt. Die Hauptnachteile Kollagengelen durch ihre geringe mechanische Eigenschaften jedoch gegenüber synthetischen Materialien 13.
In dieser Studie wurde ein lebensfähiges Gewebe mit homogener Verteilung der Zellen, die durch direktes Mischen des Kollagens mit Zellen in einer Ein-Schritt-Verfahren ausgelegt. "Static Bioreaktoren" wurden für die 1 oder 2 Wochen der statischen Reifung der cellularized Kollagengelen verwendet (ohne angelegten externen dynamischen mechanischen Einschränkungen). Während der Kultur, Kollagenmatrixumbau aufgetreten ist, wodurch eine strukturelle Verstärkung an den Konstrukten. Außerdem waren r diese Konstrukteeady auf einer sich drehenden Wand Bioreaktor überführt werden, und ein homogenes Endothel erzielt. Zusätzlich wird in dieser Arbeit eine spezifische mechanische Testprotokoll wird auch vorgeschlagen, einen geeigneten neuen Ansatz bei der Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichgewebe bereitzustellen.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, ein Verfahren zur in vitro Herstellung und schnelle Reifung vaskulären Geweben, die stark genug ist, um nicht nur für die biologische und mechanische Charakteristiken, sondern auch für weitere mechanische Konditionierung in einem dynamischen Bioreaktor, der als eine zentrale gehandhabt werden sollen Schritt bei der Regeneration von Gewebe.
In der Gemeinschaft der Gefäßgewebe Ingenieure, haben große Anstrengungen getan worden, um die für die mechanische Stabilität der Blutgefäße verantwortlich 16 Tunica media Schicht zu reproduzieren. Seit der Pionierarbeit von Weinberg und Bell 17, Kollagen wurde weithin als Gerüst für die Gefäßgewebezüchtung wegen ihrer Biokompatibilität, nicht-immunogene Eigenschaften und die Verfügbarkeit eingesetzt. Die Verwendung von Kollagen stellt aber eine große Herausforderung für die Forscher, da dieses Material nicht einfach zu handhaben, aufgrund der intrinsischen Mangel an mechanischer Steifigkeit. Manipulationen während der Gerüstvorbereitung können die Gerüste beschädigen, beeinträchtigen sie für die weitere Verwendung.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren ermöglicht: i) cellularized Kollagengele in eine röhrenförmige Geometrie zu konstruieren, ii) um biologische Gewebe zu konstruieren stark genug, um nach einer kurzen statischen Reifezeit (1 oder 2 Wochen) behandelt werden, iii) alssess mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften eines solchen rohrförmigen biologischen Geweben in 2 Richtungen. Die Zellen in dem Gel spielen eine Schlüsselrolle in der Kollagenmatrix Umbau. Während der Reifezeit, führte kontraktilen SMCs zur Verdichtung der Gele wodurch ein Konstrukt mit einer höheren mechanischen Stabilität, die in den Längs- und Umfangsrichtung beurteilt werden konnte. Danach ausgesät HUVECs in der luminalen Seite der Konstrukte erzeugt eine homogene und tragfähige Endothel und bewiesen damit die Eignung der Kollagengele für vaskuläre Gewebezüchtung.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Bioreaktor wurde speziell entwickelt, um eine optimale Umgebung für das Zellwachstum während der statischen Reifung bereitzustellen. Darüber hinaus wurden die für die Charakterisierung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Konstrukte entwickelt Vorrichtungen mit dem Ziel entwickelt, um jeden möglichen Schaden inhärent die Manipulation zu verringernwie empfindliche Materialien. Daher wurde die statische Bioreaktor ein 0,22 um Filter und einer Filtermembran auf der Kappe (Schritt 1.1.2 1A ausgestattet und B), die Gasaustausch zwischen Kulturmedium innerhalb des Behälters und dem Inkubator erlaubt, während eine sterile Kulturumgebung. Die Luer-Septum am Boden wurde als Hafen für Kulturmedium Probenahme und zum Ändern während statische Kultur. Einige wichtige Schritte müssen während Konstrukt Herstellung und Charakterisierung berücksichtigt werden. All die Manipulationen (im Schritt 2.1.1 und in den nachfolgenden Schritten durchgeführt wird), die die Sterilität des Systems nicht beeinträchtigen könnten, wurden in einer sterilen biologischen Abzug durchgeführt. Zellen und Kollagen-Gel Gemischaufbereitung wurde auf Eis, um das Gelieren verzögern behandelt (Schritte 2.1.4 bis 2.1.7). Bei Schritt 2.1.7, alle Luftblasen in der Mischung vor der Gelierung eingeschlossen sind potentielle Spannungskonzentration, die die Bereiche s gefährden könnenRentabilität der Konstrukte. Daher erfordert die Entfernung eines solchen Luftblasen leicht Schütteln der Montage oder Verwendung von Medizin Vakuum für 3 min zur Entgasung unter sterilen Bedingungen. Schließlich wurden die Griffe, die speziell für die Achse des Dorns zentral in der röhrenförmigen Form während der Gelierung zu erhalten und zu ermöglichen, dass empfindliche Manipulation der Konstrukte bei der Ernte (Entfernen des Dorns, Abschnitt 2.4) zur Endothelialisierung ausgebildet und zur Erleichterung der Montage an das mechanische System (Längs Tests).
Das vorliegende Protokoll schlägt eine Original einfach zu Prozess alternativer Ansatz der Verstärkung Kollagengelen Konstrukte auf Basis des natürlichen Eigenkontraktionspotential von SMCs. Übliche Techniken von Kollagenmatrices Verstärkung beinhalten die Verwendung von physikalischen und chemischen Vernetzungsmitteln, die schädliche Wirkungen auf die Zellen-Matrix-Interaktionen 18 aufweisen kann – 20. Die Herstellungstechnik in vorgediese Arbeit ermöglicht Leiten Sie diese Zellen getriebenen Umbauprozess, um ein Tissue-Engineering-Konstrukt mit gezielten mechanischen Eigenschaften ohne physikalische oder chemische Behandlung zu erhalten.
Charakterisierung von mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften von hydrierten Kollagengelen ist eine große Herausforderung. In dieser Hinsicht ist die vorliegende Protokoll beschreibt eine ursprüngliche einfache und effiziente Methode zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Rohrweichteile. Diese Charakterisierung kann nicht nur in Umfangsrichtung, sondern auch in der Längsrichtung direkt auf die gesamte Rohrstruktur durchgeführt werden. Während mechanische Charakterisierung, Temperatur, wässrigen Umgebung, pH und Ionenstärke sind einige der Umweltfaktoren, die bekanntermaßen stark beeinflussen das mechanische Verhalten von biologischem Gewebe 21. Daher ist die vorliegende Arbeit schlägt eine originelle Einrichtung und Protokoll für die mechanische Charakterisierung von biologischen Geweben in einem hochreproduzierbare Pseudo physiologische Umgebung (Kochsalzlösung bei 37 ° C und pH 7,4). Um das Beste aus unserem Wissen, hat diese Art der Charakterisierung nie anderswo gemeldet.
Im Ergebnis ist die in dieser Arbeit vorgeschlagene Technik zeigt das hohe Potential der direkten Mischen der Zellen mit Kollagen für Gefäßgewebe-Engineering-Anwendungen. Diese Methode zusammen mit der mechanischen Charakterisierung und Endothelialisierung Prozess bilden Hoch polyvalenten Protokolle. Daher durch leichte Modifikationen der Set-ups und Protokolle, während die gleichen Gründe, Hauptanforderungen für Engineering Gefäßgewebeäquivalenten angegangen werden, wie eine schnelle und unkomplizierte Abwicklung, einschließlich Endothelialisierung, und die Möglichkeit, auf eine Vielzahl von weichen umgesetzt werden Geweben mit verschiedenen Längen und Durchmessern. Weiterhin verschiedenen adhärenten Zelltypen ECM Proteine und Formgeometrien können für eine Anzahl ausgewählter applicati sucht werdenons, wie Engineering Sehnen, Hauttransplantationen, Herz Patches, Nerven, unter anderem. Obwohl die mechanischen Eigenschaften der Konstrukte ermutigend sind, sind sie immer noch geringer als die von nativem Gewebe. In diesem Zusammenhang haben wir davon überzeugt, dass eine sehr kurze statische Reifezeit ist ein entscheidender Schritt in Richtung der dynamischen Anregung in einen Bioreaktor und damit zu einer höheren strukturellen Integrität und mechanische Stabilität führt. Allerdings ist die Möglichkeit, schnell zu produzieren Gewebezüchtung cellularized Kollagenbasis Konstrukte für die mechanische und histologische Analysen ermöglicht die hier beschriebene eine nützliche und vielversprechende Methode, um einen Einblick in das Zusammenspiel zwischen Zellen und ECM während des Wachstums und Umbau, oder sogar bereitzustellen statischen Bioreaktor als Modell für die Therapien und Wirkstoffabgabesysteme verwendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Natural Science and Engineering Research Council of Canada, der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung und der CHU de Québec Forschungszentrum finanziert.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |