Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational
Summary
Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Recettori, soprattutto G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), sono regolarmente vittime della tratta intracellulare, da e verso la superficie cellulare 1. Questi processi complessa orchestrati e strettamente controllate dettano complementi recettori disponibili cellule 'e regolano l'attività del recettore temporali, la desensibilizzazione, e risensibilizzazione 2-4. È importante sottolineare che questi processi sono sensibili agli ambienti cellulari tra cui l'attività del recettore indotta da farmaci o di inattività. Cioè, le azioni di ligandi dei recettori possono alterare traffico intracellulare di tali recettori, alterando così la risposta delle cellule. In questo modo, leganti esterni esercitano ancora più effetti sulla funzione delle cellule, anche al di là classiche cascate 5,6 messenger-to-effettori.
Esaminando tali cambiamenti nel traffico recettoriale indotta è difficile. Tutte le tecniche disponibili prevedono limitazioni. Saggi di protezione biotina sono stati utilizzati per monitor recettori superficiali popolazioni. Questi recettori sono biotinilati e timecourse di immunoprecipitazione viene eseguita per quantificare la riduzione recettori biotinilati nel tempo. Questa tecnica controlla essenzialmente la progressiva degradazione di una iniziale, etichettati, popolazione di recettori 7, ed è molto utile nella costruzione andamenti temporali di questo processo. Purtroppo, questo test è in grado di monitorare qualsiasi processo diverso degradazione del pool originale di recettori quali internalizzazione, il riciclaggio, o nuovi recettori. Inoltre, l'aggiunta di un anticorpo nell'intervallo 150kDa ad un recettore nell'intervallo 50kDa può alterare il traffico del recettore 8,9, e questa tecnica può essere difficile da usare con recettori basso livello di espressione.
Altre procedure utilizzano vari metodi per identificare intracellulari comparti di traffico (ad esempio, endosomi, etc.) e valutare la loro colocalizzazione con i recettori di interesse. Questo include l'use dei sistemi eterologhi esprimono fluorescente proteina-tagged costrutti chimerici dei recettori e marcatori vano (GTPasi esempio, Rab-familiari). Ciò consente potenzialmente l'uso di live-cell imaging, eliminando le questioni relative alla fissazione e permeabilizzazione. Mentre potente, tale strategia soffre delle stesse limitazioni dei sistemi eterologhi in generale: effetti della modifica e del livello di espressione sul traffico di comportamento e di incompatibilità con tipi di cellule più rappresentativi fisiologicamente. Più comunemente, i coloranti vengono usati per etichettare facilmente compartimenti intracellulari (ad esempio, lisosomi, apparentemente) 10. Coloranti, tuttavia, possono mancare di specificità (tutti organuli acidi nel caso dei coloranti per lisosomi) e non valutare il traffico attraverso altri comparti. Tuttavia, queste tecniche consentono un notevole controllo sul sistema e le condizioni sperimentali e possono beneficiare di metodi di analisi colocalization presentati qui di seguito.
Il metodo we presente qui raffina il monitoraggio del traffico dei recettori per colocalizzazione. Utilizzando immunocitochimica (ICC) per etichettare marcatori appropriati, è possibile identificare più compartimenti intracellulari distinti. Questo consente anche l'uso di fisiologicamente rilevanti colture cellulari primarie in luogo dei sistemi eterologhi. Questo protocollo ICC prevede che fissa i cellule di interesse prima di etichettatura; questo permette etichettatura a timepoint specifica seguente trattamento farmacologico (s). Questo produce un 'istantanea' di associazioni recettore scomparti globali in quel timepoint. Con diversi momenti, una timecourse di cambiamenti di traffico può essere costruito.
In breve, le cellule sono trattati con farmaci, etichettati per il recettore e compartimento intracellulare di interesse, confocally ripreso, e le fotomicrografie vengono analizzati per quantificare matematicamente colocalizzazione del recettore e vano 11. Nel nostro uso, abbiamo esaminato la colocalizzazione di un recettore con Rab5, Rab11, e-lisosomiale associata proteine di membrana 1 (LAMP1). Questi marcatori identificano endosomi precoci, endosomi riciclaggio, e lisosomi, rispettivamente. Queste misure colocalizzazione agiscono come proxy per i processi generali della internalizzazione, riciclaggio, e il degrado 12.
Come con tutte le tecniche, devono essere considerate alcune limitazioni. A causa della necessità di immagine ogni singolo neurone analizzato, questa tecnica può diventare molto laborioso a seconda del numero di condizioni e timepoints coinvolti. Tutti immunomarcatura deve inoltre vedersela con gli effetti sulla ultrastruttura cellulare, la localizzazione delle proteine, e l'accessibilità epitopo causati dalla fissazione e permeabilizzazione 13.
Anche se inizialmente ottimizzato per l'uso con colture primarie di neuroni sensoriali primarie, questo metodo è ampiamente compatibile con altri modelli di coltura monostrato placcato.
L'uso di un measur matematicamente quantificatoe di colocalizzazione è, in particolare, molto più metodologicamente rigorosa rispetto alle tecniche precedenti utilizzati per valutare i cambiamenti del traffico dei recettori, che hanno spesso invocato, misure soggettive vaghi come visivamente ispezionati sovrapposizioni multicanale 14.
Questa tecnica è particolarmente utile per la sua ampia compatibilità con interventi in vivo (prima generazione coltura primaria), interventi in vitro (durante la crescita coltura), e vari etichettatura obiettivi 15. Come tale, può essere adattata a molte domande di ricerca differenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo ottimizzato questo protocollo per l'analisi delle colture primarie di neuroni adulti gangli delle radici dorsali (neuroni sensoriali primarie). Può anche essere utilizzato, con poche o nessuna modifica, per le cellule in coltura monostrato placcato ampiamente. L'analisi colocalizational è possibile anche in fette di tessuto e di altre tali preparati 11, tuttavia i componenti di trattamento farmacologico e il fissaggio del tessuto / preparazione non sarebbe appropriato.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da CIHR (MOP394808) e una sedia di ricerca del Canada a CMCEWO è stato il destinatario di una borsa di studio post-laurea da NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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