מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational
Summary
סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
קולטנים, במיוחד קולטני חלבון G בשילוב (GPCRs), באופן שיגרתי נסחרים intracellularly, ומתא השטח 1. תהליכי complexly מתוזמרים ופיקוח הדוק אלה מכתיבים משלים קולט זמין של התאים ולהסדיר את פעילות קולטן זמנית, הפחתת רגישות, וresensitization 2-4. חשוב לציין, תהליכים אלה מגיבים לסביבות סלולריות כוללים פעילות קולט תוצאת משימוש בסמים או חוסר פעילות. כלומר, הפעולות של ligands בקולטנים יכולות לשנות סחר תאיים של קולטנים אלה, ובכך לשנות את היענות תא. באופן זה, ligands החיצוני להפעיל עוד יותר השפעות על תפקוד תא, אפילו מעבר למפלי שליח למפעיל קלאסיים 5,6.
בחינת שינויים בסחר קולט מושרה היא קשה. כל הטכניקות הזמינות כרוכות מגבלות. מבחני הגנת ביוטין שימשו למוניםאוכלוסיות קולטנים משטח טור. קולטנים אלה biotinylated וtimecourse של immunoprecipitations מתבצע לכמת את הירידה בקולטנים biotinylated לאורך זמן. טכניקה זו בעצם עוקבת אחר השפלה ההדרגתית של ראשונית, שכותרתו, אוכלוסייה של קולטנים 7, והוא מאוד שימושי בבניית קורסים של תהליך זה זמן. למרבה הצער, assay זה אינו יכול לפקח על כל תהליך אחר מאשר השפלה של הבריכה המקורית של קולטנים, כגון הפנמה, מחזור, או קולטנים חדשים. כמו כן, התוספת של נוגדנים בטווח 150kDa לקולטן בטווח 50kDa יכולה לשנות הסחר של קולט 8,9, וטכניקה זו עלולה להיות קשה לשימוש עם קולטנים נמוכים ברמת ביטוי.
נהלים אחרים להשתמש בשיטות שונות כדי לזהות תאי סחר תאיים (למשל, endosomes, וכו ') ולהעריך colocalization עם קולטנים של עניין. זה כולל אותנודואר של מערכות Heterologous להביע ניאון חלבון מתויג מבני chimeric של קולטנים וסמני תא (GTPases למשל, ראב-המשפחתי). זה פוטנציאל מאפשר שימוש בLive- תא הדמיה, הסרת נושאים הקשורים לקיבעון וpermeabilization. בעוד רב עוצמה, אסטרטגיה כזו סובלת מאותן המגבלות של מערכות Heterologous באופן כללי: השפעות תג ורמת ביטוי בסחר בהתנהגות וחוסר תאימות עם סוגים יותר מבחינה פיזיולוגית נציג תא. יותר עממי, צבעים משמשים לתייג תאים תאיים בקלות (למשל, lysosomes, לכאורה) 10. צבעים, לעומת זאת, יכולים חסרי ייחוד (כל האברונים חומצי במקרה של צבעים לlysosomes) ולא להעריך סחר באמצעות תאים אחרים. ובכל זאת, טכניקות אלו מאפשרות שליטה רבה יותר במערכת ותנאי ניסוי ועשויות להפיק תועלת משיטות ניתוח colocalization שהוצגו כאן, למטה.
שיטת wדואר נוכח כאן מזקק את המעקב של סחר קולט ידי colocalization. באמצעות immunocytochemistry (ICC) לתייג סמנים מתאימים, ניתן לזהות תאים תאיים שונים מרובים. זה גם מאפשר השימוש בתרביות תאים ראשוניים מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות במקום של מערכות Heterologous. פרוטוקול ICC זה כרוך תיקון התאים של עניין לפני התיוג; זה מאפשר תיוג בנקודת זמן ספציפי הבאים טיפול תרופתי (ים). זה מייצר "תמונת מצב" של עמותות קולט-תא העולמיים בנקודת הזמן ש. עם נקודתי זמן מרובים, timecourse של שינויי סחר יכול גם להיות בנוי.
בקצרה, התאים שטופל בתרופה, שכותרתו לקולט והתא תאית של עניין, confocally צילם, וphotomicrographs מנותחים לכמת colocalization של קולט ותא 11 מתמטי. בשימוש שלנו, בדקנו את colocalization של קולט עם ראB5, Rab11, וlysosomal הקשורים חלבון הקרום 1 (LAMP1). סמנים אלה לזהות endosomes המוקדם, endosomes מחזור, וlysosomes, בהתאמה. צעדי colocalization אלה פועלים כשליחים לתהליכי העל של הפנמה, מחזור, והשפלה 12.
כמו בכל הטכניקות, כמה מגבלות יש לשקול. בשל הצורך לתמונה כל נוירון הבודד ניתח, טכניקה זו יכולה להיות די עתירת עבודה בהתאם למספר התנאים ונקודתי הזמן המעורב. גם כל immunolabeling חייב להתמודד עם ההשפעות על ultrastructure הסלולרי, לוקליזציה חלבון, ונגישות epitope נגרמות על ידי קיבוע וpermeabilization 13.
למרות מותאם במקור לשימוש עם תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים ראשוניים, שיטה זו היא רחב תואמת עם מודלים תרבות מצופה monolayer אחרים.
השימוש בmeasur לכמת באופן מתמטידואר של colocalization הוא, בעיקר, הרבה יותר מאשר מתודולוגית קפדני טכניקות קודמות שימשו להערכת שינויים בסחר בקולט, שלעתים קרובות יש לסמוך על אמצעים מעורפלים, סובייקטיבי כגון שכבות רב-ערוצים חזותי-בדקו 14.
טכניקה זו שימושית במיוחד עבור תאימות רחבה עם in vivo התערבויות (לפני דור התרבות העיקרי), במבחנה התערבויות (בצמיחת התרבות), ותיוג שונים מטרות 15. ככזה, הוא יכול להיות מותאם לשאלות מחקר רבות ושונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו מותאם פרוטוקול זה לניתוח תרבויות העיקריות של נוירונים גנגליון שורש הגבי בוגרים (תאי עצב תחושתיים ראשוניים). גם זה יכול לשמש, עם שינוי קטן או לא, לתאים בתרבית מצופה monolayer רחב. ניתוח colocalizational ניתן גם בחתכי רקמה והכנות אחרות כגון 11, לעומת זאת רכיבי הטיפול התרו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מCIHR (MOP394808) וקנדה מחקר קתדרה לCMCEWO היה הנמען של מלגת פוסט-בוגר מNSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
Referências
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
