Отслеживание наркотиков изменений, вызванных в рецептора после интернализации торговле от анализа Colocalizational
Summary
Торговля рецепторов модулирует сигнализации и клеток реагировать с лигандами и, непосредственно, в ответ на условиях клеток, включая лиганд-индуцированной сигнализации. Здесь мы описываем мощный и гибкий метод для количественного оценки оборота рецептора медикаментозного используя иммунноокрашивания и colocalizational анализ.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Рецепторы, особенно G-белком рецепторов (GPCR,), которые обычно продают внутриклеточно, и из клеточной поверхности 1. Эти сложно оркестровые и плотно контролируемые процессы диктуют доступные дополнения рецепторов клеток и регулировать рецептор временную активность, десенсибилизация и сенсибилизация 2 – 4. Важно отметить, что эти процессы реагируют на клеточных средах, включая активность рецепторов медикаментозного или бездействия. То есть, действия лигандов рецепторов в можете изменить внутриклеточный оборотом этих рецепторов, тем самым изменяя клеток реагировать. Таким образом, внешние лиганды оказывают еще больше эффектов на функции клеток, даже за пределами классической посланник-к-эффектора каскадов 5,6.
Рассматривая такие изменения в индуцированной торговли рецептора трудно. Все доступные методы включают ограничения. Анализы защиты Биотин были использованы для mõniTor поверхностных рецепторов населения. Эти рецепторы биотинилированный и timecourse из иммунопреципитации выполняется для количественного определения снижения биотинилированных рецепторов с течением времени. Эта методика по существу контролирует постепенной деградации начального, снабжены населения рецепторов 7, и это очень полезно при построении временное изменение этого процесса. К сожалению, этот анализ не может контролировать любой процесс, кроме деградации исходного пула рецепторов, таких как интернализации, рециркуляции или новых рецепторов. Кроме того, добавление антител в диапазоне 150kDa с рецептором в диапазоне 50kDa может изменить оборота рецептора 8,9, и этот метод может быть трудно использовать с низкими рецепторов уровня выражений.
Другие процедуры используют различные методы, чтобы определить внутриклеточные отсеки с торговлей людьми (например, Эндосомы, и т.д.) и оценить их колокализацию с рецепторами интерес. Это включает в себя СШАе гетерологичных системах, выражающих флуоресцентный белок-меченых химерных конструктов рецепторов и купейных маркеров (например, Раб-семейные GTPases). Это потенциально позволяет использовать визуализации живых клеток, удаляя вопросы, связанные с фиксацией и проницаемости. В то время как мощный, такая стратегия страдает от тех же ограничений гетерологичных систем в целом: TAG и уровень экспрессии эффектов на поведение и торговлей несовместимость с более физиологически представительных типов клеток. Более широко, красители используются для обозначения легко внутриклеточные отсеки (например, лизосомы, якобы) 10. Красители, однако, может не хватать специфичность (все кислые органелл случае красителей для лизосом) и не оценивают с торговлей через другие отсеки. Тем не менее, эти методы позволяют значительный контроль над системой и экспериментальных условиях и может извлечь выгоду из методов анализа колокализация представленных здесь ниже.
Метод же здесь присутствует уточняет отслеживание оборота рецепторов в колокализации. Использование иммуноцитохимии (МУС), чтобы маркировать соответствующие маркеры, можно определить несколько различных внутриклеточных отсеков. Это также позволяет использовать физиологически соответствующих первичных клеточных культур вместо гетерологичных системах. Этот протокол включает в себя МТП фиксации клеток процентов до маркировки; это позволяет маркировку на определенной временной точке после лечения (ов) лекарственного средства. Это производит «снимок» глобальной ассоциации рецептор-купе в то временной точке. С несколькими моменты времени, timecourse изменений с торговлей людьми также может быть построен.
Вкратце, клетки, обработанных лекарством, помечены для рецептора и внутриклеточное пространство интерес, конфокально отображаемого, и микрофотографии проанализированы математически количественно колокализацию рецептора и отсека 11. В нашем использования, мы рассмотрели колокализацию рецептора с Раb5, Rab11 и Лизосомные связанный мембранный белок 1 (LAMP1). Эти маркеры выявления ранних эндосом, эндосомы переработка и лизосом, соответственно. Эти меры колокализационные действовать в качестве прокси для всеобъемлющих процессов интернационализации, утилизации и деградации 12.
Как и со всеми методами, некоторые ограничения должны быть рассмотрены. В связи с необходимостью к изображению каждый отдельный нейрон анализируемого, эта методика может стать весьма трудоемким в зависимости от ряда условий и временных точках, участвующих. Все иммуномечение также должны бороться с последствиями на клеточном ультраструктуры, локализации белка и эпитопной доступности, вызванных фиксацией и проницаемости 13.
Хотя первоначально оптимизирован для использования с первичных культурах первичных сенсорных нейронов, этот метод широко совместимы с другими моделями монослойной культуры покрытием.
Использование математически количественно изме колокализации является, в частности,, гораздо более методологически строгими, чем предыдущие методы, используемые для оценки изменений с торговлей людьми рецепторов, которые часто полагались на смутных субъективных мер, таких, как визуально-контролируемых многоканальных наложений 14.
Этот метод особенно полезен для его широкой совместимостью с естественных вмешательств (до первичного поколения культуры) в интервенции в пробирке (во время роста культуры), а также различные маркировки цели 15. Как таковой, он может быть адаптирован к различным исследовательских вопросов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы оптимизировали этот протокол для анализа первичных культурах взрослых заднекорешковых ганглиев (первичные сенсорные нейроны). Она также может быть использован, практически без изменений, за монослойных покрытием широко культивируемых клеток. Colocalizational анализ можно также в срезах ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом CIHR (MOP394808) и Канада заведующая кафедрой в CMCEWO был получателем стипендии последипломного из NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
Referências
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
