Spårning Läkemedels-inducerade förändringar i Receptor Post-interna Trafficking av Colocalizational Analys
Summary
Receptorhandel modulerar signalering och cellsvar till ligander och är, i sig, som reagerar för cellförhållanden, inklusive ligandinducerad signalering. Här beskriver vi en kraftfull och flexibel teknik för att kvantitativt bedöma läkemedelsinducerad receptorhandel med användning immunomärkning och colocalizational analys.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Receptorer, särskilt G-proteinkopplade receptorer (GPCR), rutinmässigt trafikerade intracellulärt, till och från cellytan 1. Dessa komplext iscensatt och hårt kontrollerade processer diktera cellernas tillgängliga receptor kompletterar och reglera receptor timliga verksamhet, hyposensibilisering, och resensitization 2-4. Viktigt dessa processer är lyhörda för cellulära miljöer inklusive läkemedelsinducerad receptoraktivitet eller inaktivitet. Det vill säga, kan de åtgärder som ligander vid receptorer förändrar intracellulär handel med dessa receptorer, och därigenom förändra cellsvar. På detta sätt, externa ligander utövar ännu fler effekter på cellfunktion, även utanför klassiska messenger-till-effektor kaskader 5,6.
Undersöka sådana förändringar i inducerad receptorhandeln är svårt. Alla tillgängliga teknik innebär begränsningar. Biotin-skyddsanalyser har använts för att MoniTor ytreceptorer populationer. Dessa receptorer biotinyleras och tidsförloppet av immunoprecipitationer utförs för att kvantifiera minskningen av biotinylerade receptorer över tiden. Denna teknik övervakar i huvudsak den gradvisa nedbrytningen av en initial, märkt population av receptorer 7, och är mycket användbar vid konstruktion av tidsförlopp av denna process. Olyckligtvis är denna analys inte kan övervaka alla andra än nedbrytning av den ursprungliga gruppen av receptorer såsom interna, återvinning, eller nya receptorer processen. Dessutom kan tillsatsen av en antikropp i 150kDa intervallet till en receptor i 50 kDa intervallet förändrar receptorns handel 8,9, och denna teknik kan vara svåra att använda med låga expressionsnivå receptorer.
Andra förfaranden använder olika metoder för att identifiera intracellulära människohandel fack (t.ex. endosomer, etc.) och bedöma deras colocalization med receptorerna av intresse. Detta inkluderar osse av heterologa system som uttrycker fluorescerande protein-märkta chimära konstruktioner av receptorerna och fack markörer (t.ex. Rab-familjen GTPaser). Detta möjliggör potentiellt användningen av levande cell imaging, ta bort frågor som rör fixering och permeabilization. Även kraftfull, lider en sådan strategi från samma begränsningar av heterologa system i allmänhet: tag och uttrycksnivå effekter på människohandel beteende och oförenlighet med mer fysiologiskt representativa celltyper. Mer populärt är färgämnen som används för att enkelt märka intracellulära fack (t.ex. lysosomer, skenbart) 10. Färgämnen kan dock sakna specificitet (alla sura organ i fråga om färgämnen för lysosomer) och inte bedöma människohandel genom andra avdelningar. Ändå dessa tekniker tillåter betydande kontroll över systemet och experimentella förhållanden och kan dra nytta av de metoder colocalization analys som presenteras här nedan.
Metoden we närvarande här förfinar spårning av receptorn människohandel genom samlokalisering. Använda immuncytokemi (ICC) för att märka lämpliga markörer, är det möjligt att identifiera flera distinkta intracellulära avdelningar. Detta medger även användning av fysiologiskt relevanta primära cellkulturer i stället för heterologa system. Detta ICC-protokollet innebär fastställande av celler av intresse före märkning; detta medger märkning vid en specifik tidpunkt efter läkemedelsbehandling (ar). Detta ger en "ögonblicksbild" av globala receptor avdelningar organisationer vid den tidpunkt. Med flera tidpunkter, kan en tidsförloppet av förändringar människohandel också konstrueras.
I korthet, celler är läkemedelsbehandlade, märkt för receptorn och intracellulära fack av intresse, confocally avbildas, och mikrofotografierna analyseras för att matematiskt kvantifiera colocalization av receptorn och facket 11. I vår användning, undersökte vi colocalization av en receptor med Rab5, Rab11 och Lysosomala-associerat membranprotein 1 (LAMP1). Dessa markörer identifiera tidiga endosomer, återvinning endosomer och lysosomer, respektive. Dessa colocalization åtgärder fungerar som ombud för de övergripande processerna för internalisering, återvinning och nedbrytning 12.
Som med alla tekniker, bör vissa begränsningar övervägas. På grund av behovet av att bilden varje individ neuron analyseras, kan denna teknik bli ganska arbetskrävande beroende på antal villkor och tidpunkter inblandade. Alla immunomärkning måste också brottas med effekterna på cellultra, protein lokalisering och epitop tillgänglighet orsakade av fixering och permeabilization 13.
Även ursprungligen optimerad för användning med primära kulturer av primära sensoriska neuroner, är denna metod i stort sett förenlig med andra monoskikt guldpläterade odlingsmodeller.
Användningen av ett matematiskt kvantifieras measure av colocalization är, framför allt, mycket mer metodologiskt strängare än tidigare tekniker som används för att bedöma receptor människohandel förändringar, som ofta har förlitat sig på vaga, subjektiva åtgärder som visuellt inspekterade flerkanalsöver 14.
Denna teknik är speciellt användbar för sitt breda kompatibilitet med in vivo åtgärder (före primärkultur generationen), in vitro-insatser (under kultur tillväxt), och olika märkning riktar 15. Som sådan kan den anpassas till många olika frågeställningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har optimerat detta protokoll för analys av primära kulturer av vuxna dorsala ganglieneuroner (primära sensoriska neuroner). Det kan också användas, med liten eller ingen modifiering, för monoskiktserat odlade celler i stort sett. Den colocalizational analys är också möjlig i vävnadssnitt och andra sådana preparat 11, men läkemedelsbehandling och vävnadsfixering / beredning komponenter skulle inte vara lämpligt.
Av intresse kan ICC metoder som presenteras här ock…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från CIHR (MOP394808) och Kanada forskning ordförande till CMCEWO var mottagare av en Post-Graduate Scholarship från NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
Referências
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
