דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
מטרתו של מאמר זה היא לתאר בפירוט המתודולוגיה לייצר ולאפיין נוגדנים חד-שבטיים נוגדנים אנושיים המתקבלים מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs).
העניין ללמוד נוגדנים אנושיים גדל בתחומים שונים של מחקר. בפרט, קבוצות מחקר רבות מעוניינות בפתולוגיה הנגרמת על ידי נוגדנים עצמיים 1-3. יש לנו משובט ומאופיין אוטומטיים נוגדנים פתוגניים 1. המחקר של נוגדנים עצמיים יכול לעזור לזהות את המטרות שלהם ולפתח אסטרטגיות טיפוליות, למשל, באמצעות נוגדני מתחרה 4. יתר על כן, המחקר של נוגדנים אנושיים יכול להיות גם עניין בתחומים אחרים של מחקר, כלומר, כדי להעריך את התגובה החיסונית לאחר חיסון 5, לאפיין את פרופיל הנוגדן של אנשים שנחשפו והפכו עמידים לפתוגנים ספציפיים 6 או ללמוד ש נוגדנים הם בהרפרטואר הטבעי 7,12.
כמה טכניקות פותחו כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים אנושיים רקומביננטי 8-12; רוב אלה להשתמש תצוגת הפאג והנצחת B-תא. השימוש בתצוגת הפאג יושם בהרחבה לגילוי נוגדנים חדשים 13. עם זאת יש לו חסרון גדול, כלומר שהזוגות כבדה וקלת שרשרת של אימונוגלובולינים האדם להיות מנותקים בתהליך. ייצור של hybridomas עם תאי B אנושיים או שינוי EBV מתגבר על חסרון זה.
אנו משתמשים בזיהום של תאי B הרתי עם EBV בשילוב עם גירוי תא polyclonal B באמצעות קולטן-כמו אגרה 9 (TLR-9) 6,12.
במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את הטכנולוגיה שאנו משתמשים לפיתוח נוגדנים האנושיים IgG, עם סקירה של כל הצעדים מבידוד PBMC במבחנת דור הנוגדן שלם. זהפרוטוקול יכול לשמש לניתוח של כל סוג של פרופיל נוגדנים אנושי. במעבדה שלנו, תאי B מייצרים נוגדני IgG הופרדו בהצלחה משאר PBMCs לאחר המיון. חמישים B תאים ממוינים 8 אז יכולים להיות מצופים בלוחות רב-היטב והונצחו על ידי EBV וTLR-9 הפעלה, להרחבה המשובט של תאי B יחידים. כתאים מזינים, fibroblasts מרקמת ריאה עוברית אנושית כבר בשימוש, קו תא wi38, המאפשר ההדמיה של תאי B הונצחו. מתאי B אלה, ניתן להשיג הרצפים של כבדות וקלות שרשרות של אימונוגלובולין על ידי PCR, וגני 'הנוגדנים משובטים בוקטורי ביטוי G אימונוגלובולינים ומיוצרים במבחנה. שימוש בטכניקה זו, נוגדנים יחידים עם בדיוק אותו רצף הנוגדן נמצא בתורם ניתן ללמוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב היד הזה, את כל השלבים לייצור נוגדני IgG מPBMCs האנושי מוצגים בפירוט. פרוטוקול זה כולל כמה יתרונות על פני שיטות שפורסמו בעבר. אחד היתרונות הוא שהנוגדן מיוצר שומר כבדות וקלות הרשתות המתאימות לזוג המקורי בשיבוט תאי B. זיהוי של נוגדני IgG יכול להיעשות בכל סוג של תורם אנושי,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חוזה מחקר מיגל סרווט (ISCIII CD14 / 00,032) עד (GN-G.). מלגה מארגון הולנד ל" בית ספר למוסמכים של Translational תכנית Neuroscience "מחקר מדעי (022005019) ל( CH).
מענקים מPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) וFrançaise אגודת contre les Myopathies ל( PM-M.); כמו גם על ידי מלגת Veni של ארגון הולנד למחקר מדעי (916.10.148) מלגה של קרן המוח של הולנד (FS2008 (1) -28) וPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) (לML ).
אנו מודים יאספרס Jozien על עזרתה בB-מיון התא על ידי cytometry זרימה.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
Referências
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan … [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
