Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
इस अनुच्छेद के लक्ष्य में विस्तार से पैदा करते हैं और मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से प्राप्त मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी चिह्नित करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करने के लिए है।
मानव एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए ब्याज अनुसंधान के कई अलग अलग क्षेत्रों में वृद्धि हुई है। विशेष रूप से, कई अनुसंधान समूहों ऑटो एंटीबॉडी 1-3 की वजह से विकृति विज्ञान में रुचि रखते हैं। हम क्लोन और रोगजनक ऑटो एंटीबॉडी 1 विशेषता है। ऑटो एंटीबॉडी के अध्ययन प्रतियोगी एंटीबॉडी 4 का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, अपने लक्ष्य की पहचान करने और चिकित्सीय रणनीति विकसित करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, मानव एंटीबॉडी के अध्ययन में यह भी टीकाकरण 5 के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए संपर्क में है और विशिष्ट रोगजनक 6 या अध्ययन करने के लिए प्रतिरोधी बन गया है कि व्यक्तियों के एंटीबॉडी प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए, यानी अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों में ब्याज की हो सकती है, जो एंटीबॉडी में हैंप्राकृतिक प्रदर्शनों की सूची 7,12।
कई तकनीकों पुनः संयोजक मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 8-12 उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है; इनमें से सबसे फेज प्रदर्शन और बी सेल अमरता का उपयोग करें। फेज प्रदर्शन का उपयोग बड़े पैमाने पर नई एंटीबॉडी 13 की खोज के लिए लागू किया गया है। हालांकि यह बन मानव इम्युनोग्लोबुलिन की भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़े प्रक्रिया में अलग नाम से है कि, एक बड़ा नुकसान है। मानव बी कोशिकाओं या EBV के परिवर्तन के साथ हाइब्रिडोमास का उत्पादन इस खामी पर काबू।
हम टोल की तरह रिसेप्टर 9 (TLR-9) 6,12 के माध्यम से पॉलीक्लोनल बी सेल उत्तेजना के साथ संयोजन में EBV के साथ Thymic बी कोशिकाओं के संक्रमण का उपयोग करें।
इस पत्र में, हम विस्तार में हम इन विट्रो एंटीबॉडी पीढ़ी के लिए PBMC अलगाव से सभी चरणों की एक पूरी सिंहावलोकन के साथ, आईजीजी मानव एंटीबॉडी के विकास के लिए उपयोग करें कि प्रौद्योगिकी का वर्णन है। इसप्रोटोकॉल मानव आईजीजी प्रोफाइल के किसी भी प्रकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, आईजीजी उत्पादन बी कोशिकाओं को सफलतापूर्वक छंटाई के बाद PBMCs के बाकी हिस्सों से अलग हो गया है। पचास के अनुसार क्रमबद्ध बी कोशिकाओं 8 तब बहु अच्छी तरह प्लेटें में चढ़ाया और एकल बी कोशिकाओं की क्लोनल विस्तार के लिए, EBV और TLR-9 सक्रियण द्वारा अमर जा सकता है। फीडर कोशिकाओं के रूप में, मानव भ्रूण फेफड़े के ऊतकों से fibroblasts, अमर बी कोशिकाओं के दृश्य की सुविधा है, जो सेल लाइन wi38, इस्तेमाल किया गया है। इन बी कोशिकाओं से, इम्युनोग्लोबुलिन की भारी और प्रकाश श्रृंखला के दृश्यों पीसीआर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और एंटीबॉडी 'जीन इम्युनोग्लोबुलिन जी अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन और इन विट्रो में उत्पादन किया। इस तकनीक का उपयोग करना, दाता में पाया वास्तव में एक ही एंटीबॉडी अनुक्रम के साथ एक एंटीबॉडी का अध्ययन किया जा सकता है।
इस पांडुलिपि में, मानव PBMCs से आईजीजी की पीढ़ी के लिए सभी कदम विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तकनीक पर कुछ लाभ भी शामिल है। लाभ में से एक का उत्पादन किया एंटीबॉडी बी सेल क्लोन मे?…
The authors have nothing to disclose.
करने के लिए शोध अनुबंध मिगुएल Servet (ISCIII CD14 / 00,032) (जीएन-जी।)। वैज्ञानिक अनुसंधान "translational तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम के स्नातक स्कूल" के लिए नीदरलैंड संगठन (022005019) (सीएच) से फैलोशिप।
Prinses बीट्रिक्स Fonds (परियोजना WAR08-12) और एसोसिएशन Française contre लेस Myopathies करने से अनुदान (पीएम एम।); साथ ही वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन के एक Veni फैलोशिप (916.10.148) नीदरलैंड के ब्रेन फाउंडेशन के एक फैलोशिप द्वारा (FS2008 (1) -28) और एमएल Prinses बीट्रिक्स Fonds (परियोजना WAR08-12) ( )।
हम फ्लो द्वारा छँटाई बी कोशिका में उसकी मदद के लिए Jozien जैस्पर्स धन्यवाद।
Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
Primers (2μl) | Sigma | ||
Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |