塩化第二鉄誘発性頚動脈および腸間膜血管に血栓症のマウスモデル

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

血栓症および抗血栓薬の有効性の評価の開発に関与するメカニズムの研究は、十分に実験動物モデルを確立が必要です。大型動物モデルは、それらが齧歯類¹よりヒトに類似大型船を提供するように使用される最初でした。しかし、高コストは、必要な大きな施設とそれらを操作する上での困難は、遺伝的にそれらの使用に大きな欠点であり、げっ歯類の予備試験は決定的な結果を²与えた後に大型動物は、現在後期前臨床研究に制限されています。トランスジェニックおよびノックアウト株の広い可用性とインビボ試験のために必要な抗血栓薬の量を最小限に抑え、その小さなサイズで、マウスは主に血栓症の研究のために使用されています。したがって、血栓障害のいくつかのモデルは、マウス³で開発されてきました。

多くの確立された血栓症モデルがintimを混乱させる血栓⁴の形成を誘導する血流のサブ内皮細胞外マトリックスの暴露に続いて、血管壁の層。血栓は/及び凝固カスケード^5を活性化する組織因子の曝露または血小板の活性化を引き起こすコラーゲンの曝露から生じ得ます。いくつかの技術が、初期血管損傷を達成するために使用されます。 Pierangeli らは大腿静脈⁶のマイクロサージェリーツールを使用して機械的破壊モデルを開発しました。 Kikushi ら緑色光（540 nm）の⁷と関心の血管壁の特定の励起に続いて内皮細胞の脂質二重層内に蓄積する光反応性化合物（ローズベンガル）を投与することからなるモデルを説明しました。損傷はまた、短い高強度のパルスレーザー照射⁸によって誘導することができます。別の技術は、最初にラットの頸動脈に設立します塩化第二鉄（FeCl _3を ^）9の局所適用に構成されています。この場合、容器の露出は、内皮細胞¹⁰の脂質過酸化及び破壊を引き起こすのFeCl ₃で生成されたフリーラジカルに起因します。損傷は、血小板粘着及び凝集、並びに白血球の動員を誘発するいくつかの接着分子の発現を誘導します。これは、白血球、特に好中球は、血栓¹¹につながる血液凝固カスケードの活性化に重要な役割を果たしていることが実証されています。この方法は、凝固カスケードを再現するのに適しています。研究者らは、ヒトにおける血栓症は、主に病気の例で発生しているのに対し、このマウスモデルにおいて、血栓症は、通常、健康な血管において誘導され、心に留めておく必要があります。アテローム性動脈硬化の血管。

このモデルは、実装が非常に簡単であり、また、マウスにおいて有効であるように、それは今、主に使用される血栓症のモードですin vivo試験での小動物用L。また、この技術は、血管の様々な血栓の形成を誘導する可能性を提供します。ターゲット容器は大口径（頸動脈、大腿、大静脈）または小径（腸間膜、精巣挙筋^）12-14の動脈または静脈することができます。より最近では、それはまた、脳卒中¹⁵のモデルを開発するために、近位中大脳動脈で使用されました。血栓形成は、直接血小板および白血球の蛍光標識した後、生体顕微鏡検査によって観察または温度プローブまたはドップラープローブ^12,16,17との血流の減少を測定することによってモニターすることができます。このような閉塞時間、血栓形成時間または血栓サイズなど、い​​くつかのパラメータは、検討してもよいです。容器間の生理的な違いは、得られた血栓の大幅な変動に結果を検討しました。そのため、研究者らは、通常、彼らがmeasuするパラメータに応じて標的血管を選択します再および/またはそれらが調査する疾患の設定。典型的には、頸動脈のモデルは、大静脈の研究は、深部静脈血栓症の研究のために、より関連性の高いのに対し、心筋梗塞や脳卒中に関連するアテローム血栓症の研究のためのより適切です。異なる容器のアクセスも血栓の成長を測定するために使用される方法を決定します。例えば、腸間膜血管が生体内顕微鏡観察および血栓形成のダイナミクスの研究のためのこのモデルは非常に適して作るのアクセスが容易です。頸動脈は、血流の測定を可能にし、閉塞性血栓症を研究するための優れたモデルを提供しアクセスしにくいが、大きいです。

塩化第二鉄誘発される血栓症モデルは、この病理学の理解に多大な進歩を提供してきました。これは、血栓形成^18,19におけるフォン·ヴィレブランド因子の役割に焦点を当てた多くの研究で使用されています。遺伝MODIと組み合わせfication技術は、それは、血栓性疾患に関与する多くの特定の遺伝子の同定を可能にしました。ラムラニら 。例えばJAK2 ^{V617F遺伝子}のノックインが不安定血餅²⁰の加速形成に関連していることが示されています。 Zhang らは、P2Y12血小板受容体の生理的意義を調査し、血小板に特異的にこの受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスのみを、FeCl _3を ²¹で損傷した腸間膜動脈においてより迅速で安定した血栓の形成を示したことを実証しました。フィブリン分解プロセスにおける組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）の重要な役割は、この方法²²において検討されています。さらにこのモデルはまた、 インビボで多くの新規薬剤のフィブリン溶解能力をテストする簡単かつ正確な方法を提供します。例えば、Wang らは、目のためにこのモデルを使用しています活性化血小板²³を標的と新規組換えプラスミノーゲン活性化因子のE前臨床検証。この方法は、ダニ、吸血コウモリ、及び蚊の唾液から、またはターゲット^24〜27の固有の識別とヘビの毒から単離された治療用タンパク質の検証を可能にしました。これらの例は、塩化第二鉄モデルの汎用性を実証します。本稿では、二つの方法に焦点を当て、二つの異なる容器の種類に塩化第二鉄誘発される血栓症を研究します。腸間膜血管および頸動脈。

Protocol

動物に関わるすべての実験はアルフレッド医学研究および教育分署動物倫理委員会（E / 2015分の1534 / B）によって承認されました。すべての外科的操作は、全身麻酔下で行われ、動物がどの段階でも痛みを経験しませんでした。記載されている全ての実験は、非回復しています。 1.準備フィルターペーパー（1ミリメートル×2ミリメートル）の薄​​いバンドをカ?…

Representative Results

ローダミン6Gの蓄積を明らかにする腸間膜の蛍光生体顕微鏡観察は、FeCl 3をすることによって損傷した血管壁に沿って、血小板と白血球を標識しました。部分的な血栓形成の進行は200ミクロンの腸間膜血管（ 図1）でモニタされます。血栓がゆっくりと表示され、FeCl 3をへの暴露の最初の分（ 図1、tは60秒=）の後に明らかに識別可能です。 40秒のFeCl <s…

Discussion

塩化第二鉄誘発される血栓症モデルは、優れた研究ツールです。この研究で示されるように、実装が非常に容易であり、生体顕微鏡またはドップラー流量計と組み合わせて使用​​する場合には、血栓形成の良好なリアルタイムモニタリングを提供します。長時間露光とのFeCl ₃の濃度を調整する、それはまた、非閉塞または閉塞のいずれか血栓を生成する可能性を提供しています。 <…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60