Järnklorid-inducerad Trombos musmodell på Carotid Artery och tarmkäx Vessel

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

Studiet av de mekanismer som är involverade i utvecklingen av trombos och utvärdera effektiviteten av antitrombotiska läkemedel kräver väletablerad experimentella djurmodeller. Stora djurmodeller var de första att använda eftersom de ger stora fartyg mer lika människor än gnagare ^1. Men höga kostnader, de större anläggningar som krävs och svårigheten att manipulera dem genetiskt finns stora nackdelar med deras användning och stora djur är nu begränsad till sena prekliniska studier gång preliminära tester på gnagare har gett entydiga resultat ^2. Med stora tillgången av transgena och knockout stammar och deras lilla storlek som minimerar mängden antitrombotiska läkemedel som krävs för in vivo-testning, möss används främst för trombos forskning. Därför har flera modeller av trombotiska störningar utvecklats hos möss ^3.

Många etablerade trombosmodeller störa Intimett skikt av kärlväggen, följt av exponering av sub endoteliala extracellulära matrisen till blodflödet inducera bildning av blodproppar ^4. Den tromber kan resultera från exponering av kollagen som utlöser trombocyter aktivering och / eller från exponering av vävnadsfaktor som aktiverar koagulationskaskaden ^5. Flera tekniker används därefter för att uppnå den initiala kärlskada. Pierangeli et al. Utvecklat en mekanisk störning modell med en mikro verktyget på lårbensvenen ^6. Kikushi et al., Beskrivs en modell som består i administration av en bild reaktiv förening (Rose Bengal), som ansamlas i lipiddubbelskiktet i endoteliala celler följt av den specifika excitering av kärlväggen av intresse med grönt ljus (540 nm) ^7. Skadan kan också induceras genom en kort högintensiv puls laserbelysning ^8. En annan teknik för det första fastställts på halspulsådern hos råttorbestår i lokal applicering av ferriklorid _(FeCl3) ^9. I detta fall är de kärl denudation resultat från fria radikaler som genereras av _FeCl3 som förorsakar lipidperoxidation och destruktion av endotelceller ^10. Skadan leder till uttryck av flera adhesionsmolekyler utlöser trombocytvidhäftning och -aggregation samt leukocyter rekrytering. Det har visats att leukocyter, särskilt neutrofiler, spelar en avgörande roll i aktiveringen av blodkoagulationskaskaden leder till trombos ^11. Denna metod är väl lämpad att återge koagulationskaskaden; Utredarna måste hålla i minnet att det i denna musmodell är trombos typiskt induceras hos friska kärl medan trombos hos människor främst förekommer i sjuka t.ex.. aterosklerotiska kärl.

Eftersom denna modell är mycket enkel att implementera och är också effektivt i möss, är det nu används mest trombos lägel för små djur in vivo-studier. Dessutom erbjuder denna teknik möjligheten att inducera bildningen av tromber i ett antal olika kärl. Target fartyg kan vara artärer eller vener med stor diameter (carotid, lårbens, hålvenen) eller liten diameter (krös, cremaster) ^12-14. På senare tid har det också används på den proximala mellersta cerebralartären för att utveckla en modell för stroke ^15. Det trombosbildning kan observeras direkt genom intravital mikroskopi efter fluorescensmärkning av trombocyter och leukocyter eller övervakas genom mätning av blodflödesminskning med en temperatursond eller en dopplersond ^12,16,17. Flera parametrar såsom ocklusion tid, trombbildning tid eller trombstorleken kan sedan undersökas. De fysiologiska skillnader mellan fartygen undersökte medför betydande variationer i tromber erhållits. Därför utredare väljer oftast målkärlet enligt parametrar som de vill measure och / eller sjukdomen inställning de vill undersöka. Vanligtvis är den modell på halspulsådern mer relevant för forskning om aterotrombos i samband med hjärtinfarkt eller stroke, medan studier på hålvenen är mer relevanta för forskning om djup ventrombos. Tillgängligheten av de olika fartygen avgör också den metod som används för att mäta blodproppar tillväxt. Till exempel, de mesenteriska fartyg är lätta att komma åt att göra denna modell väl lämpad för intravital mikroskopisk observation och studiet av dynamiken i blodproppsbildning. Den halspulsådern är mindre tillgänglig men större möjliggör blodflödesmätningar och ger en utmärkt modell för att studera ocklusiv trombos.

Den järnklorid inducerade trombos modell har gett enorma framsteg i förståelsen av denna patologi. Det har använts i många studier som fokuserar på rollen som von Willebrand-faktor i trombosbildning ^18,19. I kombination med genetisk modificering tekniker, har det tillät identifieringen av många specifika genen involverad i trombotiska störningar. Lamrani et al., till exempel har visat att en knock-in för JAK2 ^V617F genen är associerad med en accelererande bildning av instabila koagel ^20. Zhang et al. Har undersökt fysiologiska konsekvenserna av P2Y12 trombocytreceptor det och visade att transgena möss som överuttrycker specifikt denna receptor i blodplättar endast visade en snabbare och stabilare blodproppsbildning i mesenterica skadade med _FeCl3 ^21. Den avgörande roll vävnadstyp (tPA) och urokinas-plasminogenaktivator (uPA) i processen fibrinnedbrytningsprodukter har också undersökts i denna metod ^22. Dessutom denna modell ger också ett enkelt och exakt sätt att testa de fibrinolytiska kapaciteten hos många nya läkemedel in vivo. Exempelvis har Wang et al., Används denna modell för the prekliniska validering av en ny rekombinant plasminogenaktivator riktad mot aktiverade blodplättar ^23. Denna metod gjorde det också möjligt validering av terapeutiska proteiner isolerade från saliv av fästingar, vampyr fladdermöss, och myggor eller från giftet av ormar med särskild identifiering av målet ^24-27. Dessa exempel visar mångsidigheten hos den järnklorid modellen. I den här artikeln fokuserar vi på två metoder och studera järnklorid inducerad trombos på två olika fartygstyp; mesenteriska fartyg och halspulsådern.

Protocol

Alla experiment på djur har godkänts av Alfred medicinsk forskning och utbildning Precinct Animal etikkommitté (E / 1534/2015 / B). Alla kirurgiska manipulationer utfördes under full narkos och djuren inte upplever smärta vid något skede. Alla beskrivna experimenten är icke-återhämtning. 1. Förberedelse Skär tunna band av filterpapper (1 mm x 2 mm). Färskt framställa två lösningar av ferriklorid av 4% (vikt / volym) och 6% (vikt / vol) utspäddes i avjonis…

Representative Results

Den fluorescerande intravital mikroskopi observation av tarmkäxet kommer att avslöja ansamling av Rhodamine 6G märkta trombocyter och leukocyter längs kärlväggen skadas av FeCl3. Den gradvisa bildningen av en partiell tromb övervakas i en 200 | am tarmkäxet kärlet (fig 1). En tromb visas långsamt och är tydligt identifierbara efter den första minuten av exponering för FeCl3 (Figur 1, t = 60 sekunder). 40 sekunder efter avlägsnandet av filterpapper ind…

Discussion

Den järnklorid inducerade trombos modell är ett utmärkt forskningsverktyg. Som visas i denna studie, är det extremt lätt att genomföra och när de används i kombination med intravital mikroskopi eller Doppler flödesmätare, ger det en bra realtidsövervakning av blodproppsbildning. Ställa in exponeringstiden och koncentrationen av _FeCl3, erbjuder det också möjlighet att producera antingen icke-ocklusiva eller ocklusiva tromber.

Emellertid har denna metod också vissa be…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60