זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
מחלות התוקפות את השלמות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה הן בין תנאי נוירולוגיות המתישות ביותר. בעשורים האחרונים, בפיתוח של מספר מודלים של בעלי חיים של הפרעות העצבית-שרירית אלה סיפק את הקהילה המדעית עם תרחישים טיפוליים שונים שמטרתם לעכב או היפוך ההתקדמות של תנאים אלה. על ידי ניצול של המכונות המדרדר של נוירונים, אחד מהגישות אלה היה למקד את שרירי שלד כדי גנים טיפוליים הסעות למתאימות הנוירונים מוטוריים בחוט השדרה. למרות שפעם אחת מבטיח, ההצלחה של גישת מסירת גן כזה כבר הקשתה על ידי המספר תת-אופטימלי של תאי עצב מוטורי transduced זה עד כה הוכיח להניב. צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מאוד מיוחדים על שרירי השלד שנמצאים בקשר הסינפטי ישיר לחוט השדרה α הנוירונים מוטוריים. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי, עד כה, המאמצים לretrogradelyגני העברה לתוך הנוירונים מוטוריים נעשו ללא התייחסות למיקומו של אזור MEP בשרירים הממוקדים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט 1) כדי לחשוף את המיקום המדויק של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח של שרירי שלד ו- 2) להשתמש במידע זה כדי להנחות את המשלוח תוך שרירית והתחבורה מדרדר אופטימלית הבאה של קליעים נותבים מדרדר לתוך הנוירונים מוטוריים. אנו מקווים לנצל את התוצאות מניסויי התחקות אלה במחקרים נוספים לחקירת תחבורה מדרדר של גנים טיפוליים לנוירונים מוטוריים בחוט השדרה באמצעות המיקוד של חברי הפרלמנט האירופי.
Introduction
אובדן השליטה של תנועה רצונית, הנובעת מבעיות נוירולוגיות כגון מחלת הנוירון מוטורי ושדרה, כמו גם ניוון שרירים דושן הוא מצב של חולשה שיש השפעה מתמשכת גבוהה וארוכה בחייו של כל יום של אנשים מושפעים. בעשור האחרון, מאמצי מחקר במטרה לעצור או לפחות לעכב את ההשפעות המזיקות של מחלות העצבית-שרירית אלה היו בראש סדר עדיפויות לרופאים רבים ומדען ברחבי העולם. בהקשר זה, הדור האחרון של מודלים של בעלי חיים המחקים מחלות עצבית-שרירית אלה כבר סייעו בהשגת תובנות בסיסיות למנגנונים הפיסיולוגיים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתקדמות של תנאים אלה 1-13. טיפול במחלה העצבית-שרירית אלה דורש גישה ישירה לחוט השדרה ויכולה להיות מושגת על ידי זריקות חוט השדרה 14,15. גם התקדמות בטיפול גנטי ממוקדת השרירים המשורטטים של העליון וגפיים התחתונים לגנים טיפוליים הסעות לתאי העצב המוטוריים α המתאים, הממוקמים בתוך קרן הגחון של חוט השדרה 1,9-13. עם זאת, אסטרטגיה פעם מבטיחה זה לא הצליחה לשפר את התוצאה של תנאי נוירולוגיות אלה. אמנם זה הוגן להסיק שתוצאות גרועות אלה יכולים להיות, לפחות בחלקו, להיות מיוחס ליעילות הנמוכה של גני מגן אלה, אחד לא יכול לשלול את היעילות הנמוכה של שיטות משלוח גן אלה.
צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מיוחדים של myofibres שלד שמסוכסך על ידי מסופי האקסון של סיבים מוטוריים היקפיים גדולים שמקורם α הנוירונים מוטוריים. יחד, קצות עצבי סיבים ההיקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים מהווים את הצומת העצבית-שרירית, כלומר, האתר שבו דחפים הסינפטי מופעלים על ידי שחרור אנטרוגרדית של מוליך עצבי, אצטילכולין. חשוב לציין, את מערכת היחסים בין סיבי עצב היקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים היא דו-directional, למרות שמנועים שונים אחראים להובלה של מולקולות ואברונים כיוון, כמו גם מתא העצב somata 16-18. לאור שיקולים אנטומיים אלה, חברי הפרלמנט האירופי להיראות המטרות של בחירה עבור המשלוח והתחבורה מדרדר הבאה של חומר גנטי לתאי העצב המוטוריים המקבילים. בהקשר זה, אין זה מפתיע שההצלחה של התמרה הנוירון מוטורית מאוד תלויה במרחק בין הזריקה תוך שרירית של וקטורים ויראליים וחברי הפרלמנט אירופי של השריר 19-20. באופן מפתיע, עם זאת, את המיקום המדויק של אזורי חבר הפרלמנט האירופי על myofibres של עכברוש המעבדה ועכבר, שני המינים של בחירת מודל מחלות עצבית-שרירית, לא היו זמינים עד לאחרונה.
יש לנו יצרנו מפות מקיפות של אזור חבר הפרלמנט האירופי לכמה שרירי forelimb בחולדה והעכבר 21-22. לאחרונה, שהראינו את הפרטים של הארגון של r חבר הפרלמנט האירופילאגיון לכמה שרירים של hindlimb העכבר 23 ואנחנו כרגע ניתוח התכונות של חברי הפרלמנט האירופי בhindlimb החולדה. בידיים שלנו, זריקות לשריר של קליעים נותבים מדרדר מופנים לכל האזורים חבר הפרלמנט האירופי, בשרירים אלה הולידו הנוירונים מוטוריים יותר שכותרת המשתרעים על פני מגזרי חוט השדרה יותר מאשר דווח בעבר. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שפותחו בשנים האחרונות כדי לחשוף את המיקום של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח החיצוניים כמו גם ברחבי עומק hindlimb וforelimb שרירים בשני העכבר והחולדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקוד תוך שרירית והעברת מדרדר הבאה של transgenes הטיפולי לתאי העצב המוטוריים α המתאימים לטיפול הניסיוני של מצב עצבית-שרירית אינה אסטרטגיה חדשה. לדוגמא, שיטת משלוח זו נעשתה שימוש כדי לעכב ניוון עצבית-שרירית בשלבים שונים של התקדמות ALS בSOD1 לעכברים וחולדות 1,9-12 כמו גם בע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי לבריאות ורפואה מרכז מחקר (NHMRC) מענק פרויקט לRM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
Referências
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurociência. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurociência. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
