Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Malattie che colpiscono l'integrità dei neuroni motori del midollo spinale sono tra le condizioni neurologiche più debilitanti. Durante gli ultimi decenni, lo sviluppo di diversi modelli animali di questi disturbi neuromuscolari ha fornito alla comunità scientifica con differenti scenari terapeutiche volte a ritardare o invertire la progressione di queste condizioni. Sfruttando la macchina retrograda dei neuroni, uno di questi approcci è stata quella di indirizzare i muscoli scheletrici, al fine di navetta geni terapeutici in corrispondenti motoneuroni del midollo spinale. Anche se una volta promettente, il successo dell'approccio consegna tale gene è stata ostacolata dal numero non ottimale dei motoneuroni trasdotte che finora ha dimostrato di cedere. Piastre terminali Motor (MEP) sono regioni altamente specializzati sulla muscolatura scheletrica che sono in contatto sinaptico diretto al midollo spinale α motoneuroni. A questo proposito, è importante notare che, finora, gli sforzi per retrogradotrasferimento di geni in neuroni motori sono stati effettuati senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Qui, descriviamo un semplice protocollo 1) per rivelare la posizione esatta dei deputati sulla superficie dei muscoli scheletrici e 2) di utilizzare queste informazioni per guidare la consegna intramuscolare e successivo trasporto retrogrado ottimale di traccianti retrogradi in neuroni motori. Ci auguriamo di poter utilizzare i risultati di questi esperimenti che tracciano in ulteriori studi in indagando trasporto retrogrado di geni terapeutici per spinale neuroni motori cavo attraverso la destinazione dei deputati.
Introduction
La perdita di controllo del movimento volontario che deriva da condizioni neurologiche come la malattia del motoneurone e spinal- nonché Duchenne atrofia muscolare è una condizione debilitante che ha un impatto elevato e duraturo sulla vita quotidiana di individui affetti. Negli ultimi dieci anni, gli sforzi di ricerca volti a fermare o almeno ritardare gli effetti deleteri di queste malattie neuromuscolari è stata una priorità per molti medici e scienziati di tutto il mondo. A questo proposito, la recente generazione di modelli animali che imitano queste malattie neuromuscolari è stato determinante per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi fisiologici alla base dello sviluppo e la progressione di queste condizioni 1-13. Il trattamento di queste malattie neuromuscolari richiede l'accesso diretto al midollo spinale e può essere ottenuto mediante iniezioni spinali 14,15. I recenti progressi nella terapia genica hanno mirato i muscoli striati del superiore earti inferiori a navetta geni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α che si trovano all'interno del corno ventrale del midollo spinale 1,9-13. Tuttavia, questa strategia una volta promettente non è riuscita a migliorare il risultato di queste condizioni neurologiche. Mentre è giusto concludere che questi poveri risultati potrebbero essere, almeno in parte, essere attribuibile alla bassa efficacia di questi geni protettivi, non si può escludere la scarsa efficacia di questi metodi di trasferimento genico.
Piastre laterali del motore (deputati) sono regioni specializzate delle miofibre scheletriche che sono rientrati dai terminali degli assoni di fibre motorie periferiche di grandi dimensioni provenienti da α motoneuroni. Insieme, le terminazioni delle fibre nervose periferiche e gli eurodeputati formano la giunzione neuromuscolare, cioè il luogo in cui gli impulsi sinaptici sono attivati dal rilascio anterograda del neurotrasmettitore, l'acetilcolina. È importante sottolineare che il rapporto tra le fibre nervose periferiche e gli eurodeputati è bi-tivazionale, anche se diversi motori sono responsabili per il trasporto di molecole e organelli verso e via dal neurone somata 16-18. Alla luce di queste considerazioni anatomiche, i deputati sembrano essere gli obiettivi di scelta per la consegna e il successivo trasporto retrogrado di materiale genetico alle corrispondenti motoneuroni. In questo contesto, non è sorprendente che il successo del motoneurone trasduzione dipende molto dalla distanza tra l'iniezione intramuscolare di vettori virali e europei del muscolo 19-20. Sorprendentemente, tuttavia, la posizione esatta delle zone MEP sulle miofibre di ratto e topo di laboratorio, le due specie di scelta per modellare malattie neuromuscolari, non erano disponibili fino a poco tempo.
Abbiamo prodotto le mappe complete della regione MEP per diversi muscoli degli arti anteriori nel ratto e nel topo 21-22. Più di recente, abbiamo mostrato i dettagli dell'organizzazione del deputato rEgion per diversi muscoli della arti posteriori del mouse 23 e stiamo attualmente analizzando le caratteristiche dei deputati sulla arti posteriori del ratto. Nelle nostre mani, iniezioni intramuscolari di traccianti retrogradi diretti alle intere zone MEP in questi muscoli hanno dato luogo a neuroni motori più marcati che si abbracciano segmenti del midollo spinale di più di quanto precedentemente riportato. Presentiamo qui il protocollo che è stato sviluppato negli ultimi anni per rivelare la posizione dei deputati sulla superficie esterna e per tutto lo spessore e hindlimb forelimb muscoli sia nel topo e nel ratto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il targeting intramuscolare e successivo trasferimento retrograda di transgeni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α per il trattamento sperimentale condizione neuromuscolare non è una nuova strategia. Per esempio, questo metodo di consegna è stato utilizzato per ritardare la degenerazione neuromuscolare in diverse fasi della progressione ALS in topi e ratti 1,9-12 SOD1 nonché nei topi con SMA 13. Mentre promettente, l'efficacia di questi scenari di terapia genica è stata limitata. A…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un Centro di Ricerca Nazionale Salute e medicina (NHMRC) progetto di sovvenzione a RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
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