モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
脊髄運動ニューロンの完全性に影響を及ぼす疾患は、最も衰弱性の神経学的状態の間です。過去数十年にわたり、これらの神経筋障害のいくつかの動物モデルの開発は、これらの条件の進行を遅延または逆転を狙っ異なる治療シナリオを科学コミュニティを提供しています。ニューロンの逆行性機構を利用することにより、これらのアプローチの一つは、脊髄運動ニューロンに対応するシャトル治療遺伝子のために、骨格筋を標的とするようになっています。一度有望が、このような遺伝子送達アプローチの成功は、これまでに得示した形質導入運動ニューロンのサブ最適数によって妨げられてきました。運動終板（のMEP）は、運動ニューロンα脊髄へ直接シナプス接触している骨格筋で高度に専門領域です。この点において、それは、これまで、努力は逆行することに注意することが重要です運動ニューロンへの転送遺伝子は、対象となる筋肉のMEP領域の位置を参照することなく行われました。ここでは、単純なプロトコル1）骨格筋の表面上のMEPの正確な位置を明らかにし、2）運動ニューロンへの筋肉内送達および逆行性トレーサーのその後の最適な逆行性輸送を案内するために、この情報を使用することが記載されています。我々は、欧州議会議員のターゲティングを介して脊髄運動ニューロンへの治療遺伝子の逆行性輸送を調査へのさらなる研究において、これらのトレース実験からの結果を利用したいと考えています。
Introduction
このような運動ニューロン疾患などの神経学的状態から生じる随意運動の制御の喪失とspinal-ならびにデュシェンヌ型筋萎縮症は、罹患者の毎日の生活に高く、長期的な影響を与える衰弱状態です。過去10年間、停止または少なくともこれらの神経筋疾患の有害な影響を遅らせることを目指して研究努力は、世界中の多くの臨床医と科学者のための優先事項となっています。この点で、これらの神経筋疾患を模倣する動物モデルの最近の発生は、これらの条件1-13の発生および進行の根底にある生理学的メカニズムに基本的な洞察を得ることに尽力されています。これらの神経筋疾患の治療は、脊髄への直接アクセスを必要とし、脊髄注射14,15によって達成することができます。遺伝子治療の最近の進歩は、上部の横紋筋肉を標的としていると脊髄1,9-13の前角内に配置され、対応するα運動ニューロンへのシャトル治療遺伝子に下肢。しかし、このかつて有望な戦略は、これらの神経学的状態の結果を改善するために失敗しました。それは、これらの予後不良があり得ることを結論する公正であるが、少なくとも部分的に、これらの保護の遺伝子の低い有効性に起因する、1は、これらの遺伝子送達方法の低い有効性を除外することはできません。
モーターエンドプレート（議員）は、α運動ニューロンから発信大きな末梢運動線維の軸索末端でインデントされた骨格筋線維の専門領域です。一緒に、末梢神経線維終末とのMEPは、神経筋接合部、 すなわち 、シナプスインパルスは、神経伝達物質の順行性遊離、アセチルコリンによってトリガーされる部位を形成します。重要なことは、末梢神経線維とのMEPとの関係は、二DIRECです的な、別のモータが離れてニューロン細胞体16-18から向かってだけでなく、分子や細胞小器官の輸送に関与しているが。これらの解剖学的考慮事項に照らして、MEPが対応する運動ニューロンへの送達および遺伝物質のその後の逆行性輸送のための選択の標的であることが表示されます。この文脈では、運動ニューロンの形質導入の成功は非常にウイルスベクターおよび筋肉の19-20のMEPの筋肉内注射との間の距離に依存することは驚くべきことではありません。しかし、驚くべきことに、実験用ラットとマウスの筋線維のMEPゾーンの正確な位置は、選択の2種が神経筋疾患をモデル化するために、最近まで利用できませんでした。
我々は、ラットおよびマウス21-22でいくつかの前肢の筋肉のためのMEP領域の総合的なマップを生成しています。最近では、我々はMEP rの組織の詳細を示していますマウス後肢23のいくつかの筋肉のためのegion、我々は現在、ラットの後肢上のMEPの特徴を分析しています。私たちの手では、これらの筋肉全体MEPゾーンに向かう逆行性トレーサーの筋肉内注射は、以前に報告されたよりも多くの脊髄セグメントをスパニングしている以上の標識運動ニューロンを生じさせました。ここでは、外部表面上のMEPの位置だけでなく、マウスおよびラットの両方における後肢と前肢の筋肉の深さ全体を明らかにするために、ここ数年にわたって開発されたプロトコルを提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経筋条件の実験的治療のための筋肉内ターゲティングおよび対応するα運動ニューロンへの治療導入遺伝子のその後の逆行性伝達は、新戦略ではありません。例えば、この送達方法は、SOD1マウスおよびラット1,9-12ならびにSMA 13とマウスにおいてALS進行の異なる段階での神経筋変性を遅延させるために使用されてきました。有望一方、これらの遺伝子治療のシナリオの有効性…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、RMへの国民の健康と医療研究センター（NHMRC）プロジェクトの助成金によってサポートされていました
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
Referências
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neurociência. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neurociência. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
