التصوير المباشر لالبطانة العصبية سيليا في البطينات الجانبية للدماغ الفأر
Summary
باستخدام عالية الدقة تدخل الفرق النقيض (DIC) المجهري، ويتجلى ملاحظة المجراة سابقا من ضرب أهداب بطانية عصبية متحركة تقع داخل البطينات الدماغية الماوس عن طريق الحية التصوير. هذه التقنية تتيح للتسجيل فريدة من نوعها تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية وكذلك الكالسيوم داخل الخلايا خصائص التذبذب سرعة الخاصة بهم.
Abstract
خلايا البطانة العصبية Multiciliated خط البطينين في الدماغ الكبار. ويرتبط ظيفة غير طبيعية أو بنية أهداب بطانية عصبية مع مختلف عجز عصبي. التيار فيفو السابقين التصوير المباشر متحركة تقنية أهداب البطانة العصبية يسمح لدراسة تفصيلية لديناميات الهدبية بعد عدة خطوات. وتشمل هذه الخطوات: الفئران القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون وفقا لبروتوكولات جامعة الرعاية المؤسسية توليدو الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)؛ قطع القحف تليها إزالة المخ وسهمي تشريح الدماغ مع vibratome أو شفرة حادة للحصول على المقاطع رقيقة جدا من خلال البطينين الوحشي الدماغ، حيث يمكن تصور أهداب بطانية عصبية. حضانة شرائح الدماغ في لوحة من الزجاج السفلي مخصصة تحتوي على التعديل النسر المتوسطة (DMEM) / ارتفاع الجلوكوز، Dulbecco وعند 37 درجة مئوية في ظل وجود 95٪ / 5٪ O 2 / CO 2 مزيج أمر ضروري للحفاظ على الأنسجة على قيد الحياة خلالالتجربة. ثم يتم تسجيل الفيديو من الضرب أهداب باستخدام مجهر تدخل الفرق التباين العالي الدقة. ثم يتم الفيديو تحليل الإطار من جانب الإطار لحساب التردد الهدبية الضرب. وهذا يسمح تصنيف واضح للخلايا البطانة العصبية إلى ثلاث فئات أو أنواع على أساس تردد الهدبية الضرب وزاوية. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يسمح استخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان لتحديد خصائص فريدة من نوعها داخل الخلايا خصائص التذبذب الكالسيوم من خلايا البطانة العصبية فضلا عن تأثير كلاء الدوائية على التذبذبات الكالسيوم وتردد الهدبية الضرب. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مناسبة للتصوير المناعي للهيكل الهدبية والهدبية البروتين توطين الدراسات. هذا مهم بشكل خاص في تشخيص المرض والنمط الظاهري الدراسات. ويعزى القيد الرئيسي لهذه التقنية إلى انخفاض في حي حركة أهداب متحركة كما تبدأ أنسجة المخ في الموت.
Introduction
أهداب هي عضيات القائم على أنيبيب الحسية التي تمتد من سطح الخلية إلى البيئة خارج الخلية. حسب منظمة أنيبيب، ويمكن تصنيف أهداب إلى نوعين – "9 + 0" أو "9 + 2". وظيفيا، استنادا إلى الحركة، ويمكن ان تصنف هذه كما متحركة أو غير متحركة أهداب 1. أهداب الأساسي هو مصطلح يستخدم عادة للدلالة على "9 + 0" أهداب غير متحركة. هذه تسع الأنابيب الدقيقة صدرة موازية (الرمز بواسطة '9') وزوج المركزي من الأنابيب الدقيقة غائب داخل غمد المركزي (الرمز بواسطة '0'). ومع ذلك، بعض "9 + 0" أهداب، مثل أهداب العقدي، التي تنظم الجنين تجانب هم متحركة 2. من ناحية أخرى، تتميز أهداب متحركة، بالإضافة إلى تسعة الحلل أنيبيب بالتوازي مع ذلك، عن طريق الزوج المركزي إضافي من الحلل أنيبيب والمرتبطة البروتينات داينين السيارات لتسهيل الحركة. بالإضافة إلى ذلك، بعض "9+2 "أهداب مثل أهداب الشم غير قابلة للمتحرك 3. وتتميز خلايا البطانة العصبية تبطن البطينات الدماغ والقناة المركزية للحبل الشوكي عن طريق أهداب متحركة التي تدفع السائل النخاعي (CSF) جنبا إلى جنب البطينين الدماغ 4.
الهدف العام من هذه الطريقة هو تسهيل دراسة ديناميات أهداب والتشوهات الهيكلية متحركة. صحة الدماغ والتنمية تعتمد بشكل كبير على التداول بكفاءة CSF داخل البطينات الدماغية. على سبيل المثال، وتدفق CSF طبيعي وتوازن السوائل يتطلب الضرب الطبيعي والوظيفي أهداب بطانية عصبية 5،6، والتي بدورها تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم حركة الاتجاه الخلايا العصبية ووقف الهجرة الخلية 7. على هذا النحو، غير طبيعي وظيفة الأهداب البطانة العصبية أو بنية يمكن أن يؤدي إلى تدفق CSF الشاذ، الذي يرتبط مع استسقاء الدماغ، وهي حالة طبية التي يوجد فيها تراكم غير طبيعي للCSF في بطينات بالمطر. هذا قد يسبب بالتالي زيادة الضغط داخل الجمجمة والتوسيع التدريجي من الرأس، والتشنج، رؤية النفق، والإعاقة العقلية 8.
مزايا هذه التقنية على الطرق القائمة هو أنه سمح للمرة الأولى أن يقدم ثلاثة أنواع الخلايا البطانة العصبية متميزة: I، II، III و، على أساس فريد من نوعه تردد الهدبية الضرب والضرب زاوية. يتم ترجمة هذه خلايا البطانة العصبية في مناطق معينة في الدماغ البطينين. وعلاوة على ذلك، فإن آثار العمر وكلاء الدوائية مثل الكحول وcilostazol على تغيير الأنماط الخلوية البطانة العصبية أو تعريب بهم يمكن البرهنة، الذي لم يكن ممكنا من قبل هذا التصنيف من خلايا البطانة العصبية. Cilostazol هو المانع من الفوسفو-3، وهو الانزيم الذي يتأيض المخيم لAMP وينظم أيضا الكالسيوم داخل الخلايا 9. باستخدام عالية السرعة تحليل التصوير مضان يسمح التصوير وقياس للداخل خلوية فريدة من نوعهاخصائص التذبذب الكالسيوم من الخلايا البطانة العصبية. على سبيل المثال، على حد سواء الكحول وcilostazol تغيير كبير في بطانية عصبية تردد الهدبية الضرب وكذلك الخلايا خصائص التذبذبات الكالسيوم، والذي بدوره يمكن أن يؤدي إلى تغيير في النخاعي استبدال حجم السوائل عن طريق أهداب بطانية عصبية 10. باختصار، كانت هذه التقنية الرئيسية لتوفير أول دليل على ثلاثة أنواع متميزة من خلايا البطانة العصبية مع مختلف خصائص التذبذب الكالسيوم.
في المقطع التالي، وتقدم خطوة بخطوة محة مفصلة عن الإجراء، مع إيلاء اهتمام وثيق لإعداد الأنسجة والتعامل معها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هو موضح هنا هو بروتوكول لإعداد أنسجة المخ الماوس لكل من يعيش التصوير والفحص المجهري مضان التي توفر الملاحظة السريعة والحساسة وثيقة من أهداب بطانية عصبية داخل البطينات الدماغية. ولا تقتصر هذه التقنية إلى البطين الجانبي فقط؛ يمكن استخدامه لمراقبة أهداب في البطينات ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma – a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O’Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
