Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.
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Artigo de método
Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células ependimárias Multiciliated alinhar os ventrículos no cérebro adulto. Função ou estrutura de cílios ependimária anormal está associado com várias deficiências neurológicas. A corrente ex vivo de imagens ao vivo da motilidade técnica cílios ependymal permite um estudo detalhado da dinâmica ciliares seguir várias etapas. Essas etapas incluem: ratos eutanásia com dióxido de carbono de acordo com protocolos de The University of Animal Care Institucional de Toledo e Comitê de Uso (IACUC); craniectomia seguido por remoção do cérebro e dissecção cérebro sagital com um vibratome ou lâmina afiada para obter secções muito finas através dos ventrículos laterais do cérebro, onde os cílios ependimária podem ser visualizadas. A incubação das fatias do cérebro de uma placa com fundo de vidro personalizado contendo meio de Eagle modificado (DMEM) / alta concentração de glicose de Dulbecco a 37 ° C na presença de 95% / 5% de O2 / CO2 mistura é essencial para manter o tecido vivo duranteo experimento. Um vídeo do espancamento cílios é então gravado utilizando um de alta resolução de contraste de interferência diferencial microscópio. O vídeo é então analisado quadro a quadro para calcular a freqüência de batimento ciliar. Isso permite a classificação distinta das células ependimárias em três categorias ou tipos com base na sua freqüência de batimento ciliar e ângulo. Além disso, esta técnica permite o uso de análise de imagem de fluorescência de alta velocidade para caracterizar as propriedades únicas de oscilação de cálcio intracelulares de células ependimais, bem como o efeito de agentes farmacológicos sobre as oscilações de cálcio e a frequência de batimento ciliar. Além disso, esta técnica é adequado para imagiologia de imunofluorescência para a estrutura ciliar e localização de proteínas ciliar estudos. Isto é particularmente importante em estudos de diagnóstico da doença e fenótipo. A principal limitação da técnica é atribuída à diminuição no movimento ciliar móveis vivo como o tecido cerebral começa a morrer.
Introdução
Os cílios são organelos à base de microtúbulos sensoriais que se estendem a partir da superfície da célula para o meio extracelular. Dependendo da sua organização de microtúbulos, cílios podem ser classificados em dois tipos - "9 + 0" ou "9 + 2". Funcionalmente, com base na sua motilidade, estes podem ser classificados como motilidade ou não-móveis cílios 1. Cílios é um termo comumente usado para designar "9 + 0" cílios não-móveis. Estes têm nove microtúbulos doublet paralelas (indicado por '9') e um par central de microtúbulos está ausente no interior da bainha central (indicado por "0"). No entanto, alguns "9 + 0" cílios, cílios, como nodal, que ....
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Protocolo
Os procedimentos para o uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Universidade de Toledo, em conformidade com as orientações do Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional dos Institutos Nacionais de Saúde e do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Extração de cérebro, Seccionamento e Preparação de tecidos
- Sacrifício de tipo selvagem estirpe de ratinhos C57BL / 6 por profundamente eutanásia com CO2 asfixia por 5 min. Assegurar morte por deslocamento cervical.
- Limpe a cabeça de rato com etanol 70%.
- Execute craniectomia usando t....
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Resultados
Medir a função dos cílios ependymal no cérebro do rato vivo
O método descrito neste protocolo é usado para monitorar a função dos cílios ependymal e estrutura no tecido fresco dissecado do cérebro do rato, bem como para monitorar e estudar freqüência de batimento ciliar. Os passos seguidos para alcançar uma experiência completa estão descritos em um fluxograma esquemático (Figura 1). É altamente recomendável que o experimento é conduzido dentro de um curto espaço de tempo, a.......
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Discussão
Descrito aqui é um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato, tanto para live-imagem e microscopia de fluorescência que fornece uma observação atenta rápido e sensível dos cílios ependymal dentro dos ventrículos cerebrais. Esta técnica não é limitada apenas ao ventrículo lateral; que poderia ser utilizado para observar o cílios nas outras ventrículos cerebrais. Esta técnica de imagem fornece uma transmissão ao vivo que se assemelha o movimento do CSF por batimento ciliar num ambiente ex vivo. Além .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Charisse Montgomery por seu serviço de edição. O trabalho de A. Alomran preenche parcialmente os requisitos para um mestrado em Farmacologia.Este trabalho é financiado pelo fundo inicial interno da Universidade de Toledo para WA e NIH grant (DK080640) para SMN
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM/GLICOSE ALTA | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Fosfato tamponado salina | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldeído | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Montagem Média com DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetilado anticorpo a-tubulina | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| Anticorpo anti-rato FITC | Vector Labs | FI-2000 | |
| Placa de cultura de células | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Lamínula (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems Leica | CM1860 | |
| Microscópio de fluorescência invertida | Nikon | Óleo Nikon TE2000 | 60X |
| Vidro de cobertura do microscópio 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Meio de montagem com DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI cubo de filtro | Chroma Technology |
Referências
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia....
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Reimpressões e permissões
