Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.
Aktuella undersökningar fag-värd interaktioner är beroende av extrapolera kunskap från (meta) genom. Intressant, 60 – delar 95% av alla fag sekvenser ingen homologi med nuvarande kommenterade proteiner. Som ett resultat, är en stor del av fag gener kommenterad som hypotetisk. Denna verklighet kraftigt påverkar notering av både strukturella och hjälp metabola gener. Här presenterar vi Phenomic metoder för att fånga det fysiologiska svaret (er) av en utvald värd under expression av en av dessa okända fag-gener. Multi-fenotyp analysplattorna (kartor) används för att övervaka mångfalden av värdsubstratet utnyttjande och påföljande bildning av biomassa, medan metabolomik ger biprodukt analys genom att övervaka metaboliten överflöd och mångfald. Båda verktygen används samtidigt för att tillhandahålla en fenotypisk profil som är associerad med expression av en enda förmodad fag öppen läsram (ORF). Representativa resultat för båda metoderna jämförs, highlighting fenotypiska profilskillnader en värd som bär antingen förmodade strukturella eller metaboliska fag-gener. Dessutom är de visualiseringstekniker och hög kapacitet beräkningsenheter som underlättade experimentell analys presenteras.
Virus som infekterar bakterier (aka bakteriofager eller fag) beräknas finnas på mer än 10 31 viruslika partiklar (VLP) globalt och fler än alla andra organismer i en miljö 1,2. Den första metagenomic studie som undersökte de virala samhällen som är förknippade med marina miljöer med fokus på att kvantifiera mångfalden ses inom den virala fraktion 3. Dessutom Breitbart och kollegor visar att över 65% av de virala samhället sekvenser delade ingen homologi med några sekvenser som finns i offentliga databaser. Senare metagenomic studier funnit liknande bevis: metagenomes från marina sediment i San Diego, Kalifornien innehåller 75% okända virussekvenser 4; metagenomes från hypersaline sjöar Salton havet innehåller 98% okända virala sekvenser 5; och korall associerade metagenomes innehåller 95-98% okända virala sekvenser 6. Denna ansamling av OKOMMENTERAD information har resulterat ifag genetiskt material är "den mörka materien av den biologiska universum" 7.
Genomisk karakterisering av fag bygger på att identifiera sekvenslikhet genom jämförelse mot befintliga nukleinsyra och proteindatabaser. Eftersom fag-kodad genetisk information är huvudsakligen okänd, homologibaserade metoder är ineffektiva. Inom sitt genom, fager kodar typiskt tre stora gen typer: transkription och replikationsgener, metabola gener och strukturella gener. De transkriptions- och replikationsgenerna (klass I / II-gener 8) innefattar polymeraser, primases, endo / exo-nukleaser och kinaser. Dessa gener är mycket konserverade på grund av deras betydelse i faginfektion, transkribering och replikera fag genetiskt material. Fag-polymeraser är lätt identifieras med hjälp av traditionella sekvenshomologi metoder på grund av deras globala bevarande 9 och har visat sig vara effektiva fylogenetiska markörer 10.Däremot fag metabola och strukturella gener (klass II / III-gener 8) blir allt divergerande och ofta kommenterad som hypotetiska gener.
Fag metabola gener påverkar metabola kapaciteten hos värden och är inte nödvändigtvis krävs för virusreplikation. Dessa gener, ofta kallad hjälp metabola gener 11 (AMGs), tycks modulera värd metabolism och möjliggöra optimal progression av infektion och framgång virion mognad. AMGs har satts i samband med utnyttjande och spridning av begränsande näringsämnen eller energiproduktion vägar. Några exempel Foto gener som finns i arvsmassan hos olika cyanophage 12-16, gener som är anslutna till och regleras av fosfatmetabolismen 17,18, och utnyttjande av pentosfosfatvägen för fag dNTP biosyntesen 18,19. I jämförelse, strukturella generna är bland de mitten till slutet av gener som produceras under infektion och varierar mellan olika fag-host system. Produktionen av strukturproteiner är beroende av tillgången på viral dNTP, och energipooler för deras transkription, translation, och montering 8. De kapsid och svans fiber strukturella proteiner anses som den mest avvikande av alla virala proteinkodande gener och krävs för framgångsrik virion produktion. Deras avvikelse typiskt tillskrivas den aktiva roll de spelar i utformningen av virusvärd samevolution 20. Divergerande proteiner oberoende av genen klass, lätt förbises när användning av traditionella homologi och sekvensinriktningstekniker. Ett försök att korrigera för de begränsningar som ses med strikta sekvensjämförelser har resulterat i bioinformatiska verktyg kan använda sekvens egenskaper för att bestämma förening, såsom artificiella neurala nät 21. Artificiella neurala nät (ANN) gör det möjligt att förutsäga strukturella och metabola gener kräver emellertid nedströms experimentell validering för att direkt karakteriseragenfunktion.
Syftet med detta manuskript är att tillhandahålla Phenomic protokoll med förmåga att övervaka både katabola och anabola metabolism av en värdbakterie under expression av en ny fag-gen, funktionellt förutspått genom ANN. Området Phenomics, biologi i samband med cellulära fenotyper, är väl etablerat i systembiologi för att underlätta utredningen av proteiner med okända eller pleiotrop funktion. Phenomic verktyg används för att länka fenotypisk information till genotypisk information. Vi hypotes för förmodade fag gener som deras funktion (s) kan bestämmas genom att observera värd fysiologiska effekter under fag genuttryck. För att undersöka denna hypotes, var två kvantitativa metoder valt. Multi-fenotyp analysplattorna (kartor) användes för att övervaka värdsubstratet utnyttjande och efterföljande bildning biomassa medan metabolomik uppmätta värd metabolit mångfald och relativ förekomst under tillväxt i specifik miljöpsykiska tillstånd. Förmodade strukturella och metaboliska proteiner överuttryckt i Escherichia coli och representativa resultat från båda experimenten jämförs. Många visuella tekniker och hög kapacitet bearbetning rörledningar presenteras för att underlätta experimentell replikering. Slutligen är reproducerbarhet och noggrannhet av de presenterade metoderna diskuteras i samband med förväntade fysiologiska effekter för en kommenterad kapsidprotein och fag metabola protein, tioredoxin, plus två förmodade AMGs.
Här presenterar vi Phenomic metoder för funktionell karakterisering av förmodade fag-gener. Tekniker inkluderar en utvecklad analys i stånd att övervaka värd anabola metabolism, Multi-fenotyp analysplattorna (kartor), utöver den etablerade metoden för metabolomik, kan mäta effekter på katabola metabolism. Vi gav ytterligare verktyg för att hantera stora datamängder till följd av denna teknik, vilket möjliggör hög genomströmning bearbetning och analys 24. Slutligen, genom att jämföra en kommenterad fagkapsiden protein, fag thioredoxin, två förmodade metabola fag-gener, och den genomsnittliga experimentella respons vi föreslår olika strategier för att tolka både dataset och genprodukter klasser, med betoning på identifiering av fenotypiska trender och identifiering av extremvärden.
Som nämnts, bägge metoderna mäter kvantitativt bara hälften av värdmetabolism. Att tolka den relativa funktionen hos någon av denya proteiner under utredning, data från båda metoderna som krävs för att styrka funktion. Även om detta inte är ett fokus för vårt nuvarande manuskript, är datautgångarna från varje Phenomic metod genomgår kombinations analyser som fokuserar på klustring tekniker såsom slumpmässig skog och huvudkomponentanalys. Dessutom måste hypoteser som härrör från den kombinerade analysen därefter validerats av traditionella genetiska metoder.
Slutligen, de metoder som presenteras är starkt påverkad av bakteriell fysiologi och därför följa samma normer. När företaget antingen metod, överväganden måste göras för att garantera oberoende, klon grupper experimenterat med; förorening förhindras; en enda variabel testas; och lämpliga kontroller genom sprang samtidigt. Underlåtenhet att ta hänsyn till dessa punkter kommer att leda till oklara resultat, liknande de fysiologiska analys.
Fler fenotyp analysplattor(MAP)
Utvecklingen av MAP ger en hög genomströmning och anpassningsbar analys jämfört med dagens teknik (Figur 5A och tabeller 1,2). Analysen använder förnödenheter, utrustning och grundläggande tekniker som är tillgängliga i alla mikrobiologi laboratorier. Införlivandet av en beräknings rörledning, PMAnalyzer 24, för efterföljande bearbetning och analys av data ger snabb tolkning av data. Dessutom kan både experimentella och analytiska aspekter av tillvägagångssättet lätt justeras eller anpassat för kundanpassade ändamål. Till exempel, om en stor del av uppgifterna inte klarar filtrering som beskrivs i avsnitt 4, kan man manuellt gå igenom tillväxtkurvorna för att identifiera problem. Om problemet uppstår på grund av stränga filterparametrar, kan justeringar av skriptet göras. Alternativt, om problem i samband med den experimentella processen (dvs långvarig kondens, felaktig överföring av bakteriell cells, etc.) sedan ytterligare replikat kan lätt upprepas.
Som beskrivits i al. Cuevas et 24, är PMAnalyzer en enda bash program skrivet som en wrapper skript som exekverar pars och analys skript som en sammanhållen, automatiserad pipeline. Alla skript är fritt tillgängliga från en Git-arkiv vid 25 genom att ta medianvärdet för varje tidpunkt över tre exemplar uppgifter, och därefter parameterizes logistikkurvan för att erhålla fördröjningstiden, högsta tillväxttakten, asymptote, och en ny term, Tillväxt nivå. Medianvärdet valdes över medelvärdet i vår studie för att minska effekten av stora extremvärden, emellertid skriptet kan lätt anpassas för att beräkna medelvärdet av likadana uppgifter. På grund av minskad variation (SE) sett över replikera data (Figur 2A) vi upprätthålls användningen av medianen i PMAnalyzer för montering en logistisk kurva. Dessutom avskurna för tillväxt i denna studie (GL ≥ 0,4) var DETErmined genom att jämföra hur data separerade över tillväxtnivå och maximal tillväxthastighet (Figur 1A, B). Beroende på instrument och modellsystem som används denna term kan variera, kräver omdefiniering av detta avbröt värde.
En stor fördel med vår analys är förmågan att jämföra fenotyper med en enda parameter som kännetecknar övergripande mikrobiell tillväxt, som vi definierar som tillväxtnivån (GL). GL är en harmoniska medelvärdet, och därför lindrar effekterna av stora avvikelser i uppgifterna. Användningen av ett harmoniskt medelvärde med förskjutna logistik utrustat värden för att ge en översikt över tillväxten kommit fram till genom trial and error. Andra metoder försökt att skilja tillväxten ingår: tid det tog att nå specifika kurvparametrar (halv μ max, μ max, och bärförmåga), determinationskoefficienten (R 2), och kombinationer av R 2 multiplicerat med särskilda kurvan parametrar. Med hjälp av ett harmoniskt medelvärde med skiftatlogistic-fit värden för GL under förutsättning att största utbudet att utvärdera tillväxt, så det blev metod. Ett övervägande att notera är att dynamiska tillväxtkurva mönster har potential att försvinna vid användning av en enda parameter eller en monterad modell. Till exempel, de individuella kurvan parametrar hos logiska kurvan och GL är oförmögna att representera bifasisk tillväxt. I en enkel kol miljö, denna effekt på tillväxt innebär förmedling av det virala proteinet på endera omvandlingen av substratet eller förskjutning i substratanvändning. Ytterligare effekter potentiellt förlorade när de inte överväger flera tillväxtparametrar inkluderar: långvarig fördröjning, föreslår en ökad belastning av viral maskiner eller produkter; snabbt accelererande exponentiell fas, vilket tyder på virala proteiner kopplade till värd energiproduktion vägar; eller högre nivåer av bildandet av biomassa, vilket innebär viral stöd i värdnäringsupptag och anabolism (data visas ej). Således, rita begynnande tillväxtkurvor ( <stRong> Figur 2A, B) ger information om trender över tid medan GL beaktar de viktigaste variablerna i logistikmodell som ger ett kvantitativt nummer att representera totala framgången för en klon.
När man överväger de olika svaren bidragit med strukturella och metabola gener i kartorna är det konstateras att de olika substratklasser i fråga ger störst bevis för proteinfunktion. Till exempel är metaboliska proteiner ofta förknippade med förvärv av begränsande näringsämnen, som är ospecifik för att vara värd centrala metabolismen 16,32. Preliminära MAP experiment avslöjar att kloner som härbärgerar förmodade metaboliska fag gener har en ökad fördröjningsfas när den odlas på centrala metabolismen kolkällor (Figur 2A). Omvänt, kloner som bär förmodade strukturella gener, som kräver stora delar av värd energi- och dNTP pooler, resultera i ett falskt positivt svar på tillväxt för procentRAL och aminosyrametabolismen kolsubstrat. Detta beror sannolikt på grund av ansamling av olösliga proteiner resulterar i värd filamentation och / eller inklusionskroppar, som observerats via mikroskopi (Figur 2A och data visas ej). Medan ytterligare analys krävs för att bekräfta dessa preliminära resultat, kartorna kan hämta fenotypiska svar som korrelerar till en hypotes funktioner specifika fag gen klasser.
Förutom att klarlägga okända virusproteiner, kartorna en ny resurs för att undersöka den funktionella och metabolisk mångfald av en enskild bakterie eller en gemenskap av bakterier. MAP komponenter är konstruerade för enkel förändring för att stödja framväxten av en rad bakterier; inklusive marin, auxotrofa och anaeroba mikrober. För att underlätta dessa ansträngningar definierade basala och pre-tillväxtmedia kräver ytterligare eller justerade kemiska ämnen vid en annan bakterieart kan stödjas i kartorna.En anmärkning i denna användning av kartorna är att upprätthålla definierade medier, som förbjuder användningen av ingredienser såsom trypton, jästextrakt och pepton.
Metabolomik
Området för metabolomik är beroende metabolit databaser, som omfattar isolerade metaboliter identifieras genom masspektrometri. Kärnan anläggning som valts här har en av de största metabolomik databaser. Intressant, mer än hälften av de metaboliter som härrör från våra experiment var oidentifierbara (~ 65%), medan andra hade aldrig tidigare spelats in i vår värd, Escherichia coli (exempel: Indol 3 ättiksyra 33, salicylsyra 34, och dihydroabietinsyra 35). Detta faktum kan tillskrivas antingen en stark slagsida av databasen mot växtmetaboliter, eller specifika proteiner under utredning. Oavsett, är resultatet ett begränsat antal kända metaboliter som datarepresentation och analys. I fuTure, flera metabolomik metoder som använder olika databaser skulle möjliggöra större metabolit täckning.
För närvarande både kända och okända metaboliter används när man jämför och kontrastera våra nya virusproteiner. Med hjälp av denna metod, vi hypotesen att kloner som härbärgerar funktionellt liknande proteiner kommer att dela en ökad likhet i deras fullständiga metabolomic profil. Preliminär metabolomik analys visade att medan strukturella och metabola gener inte tydligt åtskilda från varandra, de gener som uppvisar liknande effekter på värden när uttryckt korrelerar (Figur 6). Till exempel, de kommenterade kapsidgenen kluster tätt med de förmodade metabola gener lyfts fram i denna studie, EDT2440 och EDT2441. Undersökningar som använder en allmänt tillgänglig trans topologi och signalpeptid prediktor programmet visade tecken att båda förmodade metabola gener hyser en enda transmembrandomän. Intressant 5 av the 9 kloner i det första klustret gruppen (mest vänstra delen av dendrogram) har förutspått transmembrandomäner med samma topologi programmet. Ytterligare undersökningar behövs, är det emellertid troligt att metaboliterna närvarande vid överuttryck av dessa kloner är förknippade med cellulär stressrespons till följd av membran eller strukturella bördor. Detta bevis stöder att medan uppgifter metabolomik besitter en ökad mängd av buller, är metoden kan lyfta fram signaler som skiljer allmänna effekter av gener, både inom och mellan en gen klass. För att avgöra om metoden är kapabel att extrahera ut specifik information av geners funktion, var metaboliter grupperade i specifika metaboliska vägar. Hypotesen är, om en klon påverkar metaboliter som är specifika för en enda väg, då överuttryckta genen är aktiv i den vägen. Före etableringen av vår pipeline metabolomik kvalitetssäkring, visade preliminära data som över end underrepresenterade metaboliter var typiskt "okända", som ger lite information om de vägar som de är associerade med (data visas ej). Förbehandlade metabolomik uppgifter avslöjar emellertid att majoriteten av metaboliten profiler är likartade och endast ett begränsat antal okända och kända metabolit abundances varierar mellan kloner, exempelvis putrescin och uracil (Figur 6). För att ge större upplösning av proteinfunktion ansträngningar görs för att experimentellt jämföra de nya fag gener mot kända fag-gener, som kan användas för att fylla i "hål" i metabolit baserade funktionell karakterisering. Med hjälp av denna teknik ger den tilldelade funktionen kända virusgener en referens för funktionen av de okända gener. Icke desto mindre är den begränsande faktorn för metabolomic analys storleken och relevansen av databasen. För att korrigera för dessa begränsningar, metabolomic databaser relatable till denna forskning behöver utvecklas; sådansom en databas av metaboliter och deras abundances specifika för ASKA samlingen av E. coli-kloner i vilka en enda ORF är överuttryckt 36. Bevis för behovet av sådana databaser lämnades under 2013 när forskare vid Lawerence Berkeley National Laboratory samman den första heltäckande databas av metaboliter som är specifika för hela muterade bibliotek av modell bakterier 37. Denna forskning tillgänglig ny inblick i gener som krävs för användning av särskilda metaboliter, avslöjar tydligt samband mellan fenotyp och genotyp.
När man överväger metabolomik som ett verktyg, är det viktigt att definiera regimen behandling följde på kärnanläggningen. En artefakt av de flesta experimentella procedurer är dagen till dag variansen i samband med instrumenten för användning. Till dags dato alla GC-MS-analys genomför användningen av interna normer som ingår i varje analysomgång; dock tillsättning av projektspecifika interna prover </ Em> sprang varje dag av experimenterande bort ytterligare varians. Dessa överväganden måste åtgärdas tidigt för att undvika normaliseringsproblem och fördomar. En annan lösning är att behandla alla prover vid en kärnanläggningen på samma dator och som ett enda parti, ett alternativ tillgängliga vid varje kärnanläggningen.
De olika verktyg både infördes och åter utforskas i detta manuskript tillhandahålla nya medel för att screena och karakterisera funktionellt okända fag-gener. Enkelheten och anpassningsförmågan hos de experimentella tekniker med effektivisera användningen av beräkningsenheter säkerställer dessa metoder kan tillämpas på ett brett spektrum av forsknings strävanden och fält. Vårt mål är att Phenomic metoder som presenteras här kommer att hjälpa ytterligare undersökningar av nya fagproteiner förutom system som är lika funktionellt odefinierad.
The authors have nothing to disclose.
We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.
0.22µm Sterivex Filter | Fisher Scientific | SVGP01050 | Millipore |
0.22µm Millex Filters | Fisher Scientific | SLGV033RS | Millipore |
0.22µm SteriCap Filter | Fisher Scientific | SCGPS02RE | Millipore |
0.22 µm Omnipore membrane filters | Millipore | JHWP02500 | Millipore |
96 well micro-titer plates | VWR | 82050-764 | Standard F-Bottom 96 well Microplates |
2 mL 96 well plate | Fisher Scientific | ||
Adhesive Seal Plate Film | Sigma-Aldrich | Z369667 | |
2 L Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-70 | |
125 mL Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-50 | |
1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon | Cole Parmer | EW-45509-04 | |
Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb 1/16inch | Cole Parmer | EW-45500-30 | |
Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch | Cole Parmer | EW-45500-34 | |
Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing | Cole Parmer | EW-45505-31 | |
Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | T-45508-80 | |
Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD | Fisher Scientific | 6149-0002 | |
Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD | SaniPure | AR400002 | |
Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID | SaniPure | AR400007 | |
Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump) | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
Magnetic Stirrer | Velp Scientifica | F203A0160 | |
Forceps | Fisher Scientific | 14-512-141 | Millipore* Filter Forceps |
Multi-plate spectrophotometer plate reader | Molecular Devices Analyst GT | ||
Filter manifold | Fisher Scientific | XX10 025 02 | |
Software: | |||
Python version 2.7.5 | http://www.python.org/ | ||
PyLab module | http://wiki.scipy.org/PyLab | ||
R version 3.0.1 | http://www.r-project.org/ | ||
reshape2 library | http://had.co.nz/reshape | ||
ggplot2 library | http://ggplot2.org/ | ||
Gene Composer | PSI Tech Portal | http://www.genecomposer.net | |
Services: | |||
West Coast Metabolomics Center | UC Davis | http://metabolomics.ucdavis.edu | |
DNA 2.0 | https://www.dna20.com |