Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
यह काम एक गैर छोड़नेवाला के संश्लेषण की रूपरेखा, cyclometalated आईआर (तृतीय) परिसर, आईआर (PPy) 2 (एच 2 ओ) 2 एक histidine- करने के लिए समन्वित जब एक तेजी से, लंबे समय रहते स्फुरदीप्त संकेत प्राप्त की जाती है, जो (+ Ir1), एक चुंबकीय कण की सतह पर स्थिर प्रोटीन युक्त। Ir1 के संश्लेषण, उच्च पैदावार में, / एन पूरा हे और solvated परिसर के दो समकक्ष में आईआर (तृतीय) क्लोरो-पाट डिमर cyclometalated माता पिता के बंटवारे शामिल है। विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, संश्लेषित जांच करने के लिए कहा है जब कई अमीनो एसिड समन्वय गतिविधि के लिए जांच कर रहे थे, और केवल हिस्टडीन एक संकेत प्रतिक्रिया हासिल। BNT-द्वितीय, मलेरिया बायोमार्कर Histidine युक्त प्रोटीन द्वितीय (pfHRP II) की एक branched पेप्टाइड नकल का प्रयोग, इरीडियम जांच एचआरपी-द्वितीय का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में मान्य किया गया था। एल Histidine / Ir1 की तुलना में जब शमन प्रभाव BNT-द्वितीय / Ir1 अनुमापन में उल्लेख किया गया है, लेकिन इन steric बाधा और त्रि के लिए जिम्मेदार ठहराया गयाराज्य शमन plet। Biolayer इंटरफेरोमेट्री BNT-द्वितीय के साथ Ir1 की बातचीत की वास्तविक समय कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रणाली अनुकूलित किया गया था एक बार, जांच का उपयोग rcHRP-द्वितीय का पता लगाने की सीमा समाधान में 12.8 एनएम हो पाया था। इस प्रोटीन एक 50 माइक्रोन चुंबकीय agarose के कण की सतह पर स्थिर रहा था, पता लगाने की सीमा 14.5 एनएम था। मजबूत संकेत इस अकार्बनिक जांच की प्रतिक्रिया है, साथ ही समाधान में प्रयोग के अपने लचीलापन या एक सतह पर स्थिर, नैदानिक उपयोग से इमेजिंग के लिए आवेदनों की एक किस्म की ओर ही उधार कर सकते हैं।
वर्णमिति और फ्लोरोसेंट लेबलिंग जैव रासायनिक अणुओं का पता लगाने और ट्रैकिंग के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है और 1,2 संसाधित करता है। सबसे आम फ्लोरोसेंट मार्करों कम आणविक भार कार्बनिक रंजक 3,4 रहे हैं, लेकिन इन अणुओं हमेशा आदर्श ऑप्टिकल गुण नहीं है। फ्लोरोसेंट रंजक अक्सर छोटे स्टोक्स पारियों है, और अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा हो सकता है, photobleaching से ग्रस्त हैं। वर्णमिति लेबलिंग अक्सर Immunoassay मात्रा का ठहराव 5,6 में उपयोगी एक प्रवर्धित संकेत है जो एंजाइमी लेबल, के उपयोग से हासिल की है। ये एंजाइम भी photosensitivity, स्थितियों की प्रतिक्रिया है, और कम सब्सट्रेट शेल्फ जीवन सहित अपनी कमियां हैं। इन गुणों महंगा अभिकर्मकों का उपयोग कर अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों के तहत किया जा करने के लिए immunoassays और प्रोटीन लेबलिंग विधियों की आवश्यकता होती हैं।
छोड़नेवाला संक्रमण धातु परिसरों एक वैकल्पिक लेबलिंग दृष्टिकोण के लिए के रूप पता लगाया गया हैजैव रासायनिक पता लगाने आर। विशेष रूप से, (तृतीय), 7-9 ऑक्सीजन 10 संवेदन कार्बनिक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (OLEDs) के संदर्भ में अध्ययन 11 कटैलिसीस, और प्रोटीन / सेल 12-14 धुंधला कर दिया गया है आईआर cyclometalated। उच्च photostability और क्वांटम दक्षता जांच के इस वर्ग बायोमोलिक्यूल पता लगाने 15,16 के लिए एक अच्छे उम्मीदवार बनाने के। यह पहले से फार्म की, (iii) परिसरों आईआर cyclometalated पाया गया कि [आईआर (सी ^ एन) 2 (Solv) 2], अचल हिस्टडीन बाँध और एक नीली-हरी झंडी प्रतिक्रिया 12,17 प्रकाश में लाना। इन परिसरों solvento राज्य में गैर-छोड़नेवाला हैं, लेकिन हिस्टडीन विलायक अणुओं से हटाता है और धातु केंद्र को बांधता है, वे लंबी लहर पराबैंगनी विकिरण के बाद एक गहन स्फुरदीप्त संकेत जारी है। यह संकेत केवल ligand के प्रतिस्थापन के बाद होता है, और धातु ligand के चार्ज हस्तांतरण के सक्रियण के माध्यम से जमीन राज्य के लिए आराम एक triplet राज्य इलेक्ट्रॉन के परिणाम (3 एमएल हैसीटी) और ligand केन्द्रित हस्तांतरण (3 नियंत्रण रेखा) 8,15 रास्ते। इन परिसरों संभावित हिस्टिडीन युक्त प्रोटीन के लिए पता लगाने के जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
हिस्टडीन युक्त प्रोटीन और उनके विनियमन के स्तर को लीवर सिरोसिस, कैंसर, और thrombic विकारों सहित कई रोगों में महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से 18 प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम Histidine युक्त प्रोटीन द्वितीय (pfHRP II) मलेरिया परजीवी के संक्रमण के लिए एक अच्छी तरह से मान्य बायोमार्कर है। इस प्रोटीन ज्यादातर विशेषता AHHAHHAAD दोहरा रूपांकनों 19 के भीतर, 67 केडीए है और 34% हिस्टिडीन होता है। ये हिस्टडीन दोहराता मुक्त धातु आयनों 19 बाध्य कर सकते हैं और हीम मेजबान खून में 20 परिसरों। pfHRP-द्वितीय सामान्यतः immunochromatographic तेजी नैदानिक परीक्षण (RDTs) का उपयोग कम संसाधन सेटिंग में पाया जाता है, लेकिन इन परीक्षणों के कारण नमूना स्थिति, कम बायोमार्कर एकाग्रता, गरीब विनिर्माण मानकों, और एंटीबॉडी गिरावट 21 को अक्सर गलत कर रहे हैं।
<p class="Jove_content"> ऐसे cyclometalated IR के रूप में धातु आधारित स्फुरदीप्त जांच (तृतीय) ऊपर वर्णित परिसरों के कारण हिस्टडीन के अपने चुनिंदा बाध्यकारी और उनके स्थिर और कुशल उत्सर्जन गुणों के pfHRP-द्वितीय का पता लगाने के लिए आकर्षक विकल्प हैं। इस पत्र में, का उपयोग [आईआर (PPy) 2 (एच 2 ओ) 2] (+ Ir1) BNT-द्वितीय, 22 का पता लगाया है pfHRP-द्वितीय की एक branched पेप्टाइड नकल पता लगाने के लिए। इस बातचीत के कैनेटीक्स biolayer इंटरफेरोमेट्री तकनीक का उपयोग कर वास्तविक समय में निगरानी की गई। परख भी पता लगाने की nanomolar सीमा प्राप्त किया गया है, जहां एक ऑन-मनका एलिसा प्रकार प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया गया। यह बजाय 4-5 घंटा और ठेठ ELISAs के साथ आवश्यक जैविक अभिकर्मकों की, एंटीबॉडी से मुक्त अभिकर्मकों के साथ 2 घंटे के तहत में किया जा सकता है क्योंकि यह परख परंपरागत ELISAs से अधिक लाभ रखती है।Microparticle आधारित नैदानिक उपकरण आधुनिक निदान तकनीक के आगे के लिए आते हैं, सीधे कण की सतह पर लक्ष्य के biomolecules का पता लगाने के लिए एक बड़ा फायदा है। ऐसे एलिसा और पीसीआर के रूप में पारंपरिक आणविक तरीकों का पता लगाने में है कि वे पता लगाने के 25 में से बहुत कम सीमा प्राप्त कर सकते हैं, फायदेमंद हैं। हालांकि, इन assays व्यापक अभिकर्मकों और लंबा प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यह परख समय और अभिकर्मक आवश्यकताओं (चित्रा 5) के बिना एलिसा प्रकार सैंडविच बातचीत की नकल करने के लिए डिजाइन किया गया था। एक ठेठ एलिसा के लिए एंटीबॉडी की लागत नमूना प्रति $ 0.20-0.30 है जबकि इसके अतिरिक्त, नमूना प्रति Ir1 जांच की लागत, एक पैसा के आसपास होने का अनुमान था।
ऊपर वर्णित विधि मलेरिया बायोमार्कर का पता लगाने के लिए एक cyclometalated इरिडियम जांच पर भरोसा करते हैं के बाद से, इस जांच को अन्य तरीकों का पता लगाने के लिए आम विफलता मोड (यानी। फ्लोरोफोरे quenchi के लिए अतिसंवेदनशील नहीं होगाएनजी और एंटीबॉडी / एंजाइम गिरावट)। Histidine इसकी धातु बाइंडिंग गुण आप में अनूठा है। उल्लिखित काम धातु युक्त परिसरों के साथ एक ठेठ एलिसा सैंडविच में एंटीबॉडी की जगह द्वारा इस घटना का फायदा उठाते हैं। नी (द्वितीय) NTA के कण की सतह पर rcHRP-द्वितीय कब्जा है और Ir1 प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत है। परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम चुंबकीय कणों नमूना है और जांच के साथ मिश्रण करने की अनुमति है। एक 96 अच्छी तरह से थाली एलिसा में, biomolecules और अभिकर्मकों अच्छी तरह से नीचे की दो-आयामी सतह के साथ संतुलन तक पहुँचने। चुंबकीय कणों की वजह से उपलब्ध बाध्यकारी साइटों को कम करेगा जो उनके घने लोहे के आक्साइड कोर, का हल के बाहर समझौता करने की प्रवृत्ति है। इस प्रकार, कणों अधिक से अधिक बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए परख समय के दौरान मिश्रित किया जाना चाहिए।
रोग निदान के लिए एक अभिकर्मक डिजाइनिंग, एक मन में रोगी के नमूने के रूप के रूप में अच्छी तरह से बायोमार्कर की शारीरिक एकाग्रता रखना चाहिए। के लिएमलेरिया, एक रोगी के रक्त में पीएफ एचआरपी-द्वितीय की एकाग्रता उच्च nanomolar को कम picomolar से भिन्न हो सकती हैं। इस परख संक्रमण के उच्च स्तर के लिए नैदानिक प्रासंगिक है, पता लगाने की सीमा कम picomolar एचआरपी-द्वितीय पीएफ परिसंचारी साथ स्पर्शोन्मुख रोगियों का पता लगाने के क्रम में सुधार की जरूरत है। ऊपर उल्लिखित तरीकों, में "स्विच" पर Ir1 द्वारा उत्पन्न संकेत हिस्टडीन की उपस्थिति में होता है। मलेरिया बायोमार्कर हिस्टिडीन में समृद्ध है, वहीं इस तरह के मानव सीरम albumin और हिस्टडीन अमीर ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में अन्य सीरम प्रोटीन, जांच के साथ एक संकेत प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना होगा। यह बदले में झूठी सकारात्मक निदान के लिए नेतृत्व करेंगे। यह एक लाभकारी कदम है, उस में ब्याज की प्रोटीन तेजी से एक मरीज के नमूने से निकाला जा सकता है कण की सतह पर प्रोटीन का कब्जा बना देता है। इसके अतिरिक्त, एक bifunctional जांच, डिजाइन एक मजबूत आणविक मान्यता तत्व करने के लिए जोड़ों के लिए एक हिस्टडीन अमीर पेप्टाइड (अर्थात। Aptamer कि), परख करने के लिए विशिष्टता की एक और परत जोड़ सकते हैं। पेप्टाइड aptamer करने के लिए युग्मन से पहले इरीडियम के साथ लोड किया जाएगा। Aptamer के साथ लक्ष्य विशिष्टता प्राप्त करने, जबकि इस तरह के एक डिजाइन में, स्थिर Ir1 जांच अभी भी उपयोग किया जा सकता है। यह एक जटिल मैट्रिक्स (अर्थात। प्लाज्मा या पूरे रक्त) में देशी एचआरपी-द्वितीय का पता लगाने और गैर विशिष्ट बंधन प्रभाव को कम करने के लिए जांच के आवेदन के लिए अनुमति होगी। आगे तेजी नैदानिक परीक्षण के संकेत को बढ़ाने के क्रम में, परख पीएफ एचआरपी-मैं-मैं एक विद्युत readout के 26 के रूप में RDTs पर पता लगाया जा सकता है, जहां एक electrochemiluminescent (ईसीएल) प्रणाली है, में शामिल किया जा सकता है। यह अगली पीढ़ी इरिडियम जांच बहुत रोग बायोमार्कर का पता लगाने के लिए हमारे पर मनका एलिसा परख में वृद्धि होगी।
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |