Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Detta arbete beskriver syntesen av en icke-emitterande, cyclometalated Ir (III) -komplexet, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som framkallar en snabb, långlivat fosforescerande signal när koordinerad till en histidine- innehållande protein immobiliserat på ytan av en magnetisk partikel. Syntes av IR1, i höga utbyten, är komplett O / N och involverar klyvning av moder cyclometalated Ir (III) klor-överbryggade dimeren i två ekvivalenter av den solvatiserade komplexet. För att bekräfta specificiteten har flera aminosyror sonde för samordningsverksamhet när de läggs till den syntetiserade sonden, och endast histidin framkallade en signal svar. Använda BNT-II, en grenad peptid imitatör av malaria biomarkör Histidin rika protein II (pfHRP-II), var iridium sonden validerats som ett verktyg för HRP-II-detektering. Släcka effekter noterades i BNT-II / IR1 titrering vid jämförelse med L-histidin / IR1, men dessa var skrivas steriskt hinder och triPlet tillstånd släckning. Biolayer interferometri användes för att bestämma realtids kinetiken för interaktionen av IR1 med BNT-II. När systemet var optimerad, var detektionsgränsen av rcHRP-II med hjälp av sonden visade sig vara 12,8 nM i lösning. När detta protein immobiliserades på ytan av en 50 ^ m magnetisk agaros partikel, var detektionsgränsen 14,5 nM. Den robusta signalsvar av detta oorganiska sond, liksom dess flexibilitet i användningen i lösning eller immobiliserade på en yta, kan lämpa sig mot en mängd olika tillämpningar, från diagnostik till avbildning.
Colorimetric och fluorescerande märkning är en viktig metod för att upptäcka och spårning av biokemiska molekyler och processer 1,2. De vanligaste fluorescerande markörer är lågmolekylära organiska färgämnen 3,4, men dessa molekyler har inte alltid ideala optiska egenskaper. Fluorescerande färgämnen är benägna att fotoblekning, ofta har små Stokes skift, och kan ha överlappande excitations- och emissionsspektra. Kolorimetrisk märkning uppnås ofta med hjälp av enzymatiska märkningar, som har en förstärkt signal användbar i immun kvantifiering 5,6. Dessa enzymer har också sina nackdelar, inklusive foto, reaktionsbetingelser, och korta substrat hållbarhet. Dessa egenskaper tenderar att kräva immun och proteinmärkningsmetoder göras under väl kontrollerade förhållanden med hjälp av dyra reagens.
Emitterande övergångsmetallkomplex har undersökts som ett alternativ märkning for biokemisk detektion. I synnerhet cyclometalated Ir (III) har studerats i samband med organiska lysdioder (OLED) 7-9 syre avkänning 10, Catalysis 11, och protein / cellfärgning 12-14. Hög foto och DQE gör denna klass av sonder en bra kandidat för biomolekyler upptäckt 15,16. Man har tidigare funnit att cyclometalated Ir (III) -komplex, av formen [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] ^, irreversibelt binda histidin och framkalla ett blågrönt signalsvar 12,17. Dessa komplex är icke-emissiv i solvento tillstånd, men när histidin förskjuter lösningsmedelsmolekylerna och binder till metallcentrumet, släpper de en intensiv fosforescerande signal efter långvågig UV-bestrålning. Denna signal uppträder endast efter ligand substitution, och är resultatet av ett triplettillstånd elektron kopplar till grundtillståndet genom aktivering av metalligand laddningsöverföring (3 MLCT) och ligand centrerad överföring (3 LC) vägar 8,15. Dessa komplex kan potentiellt användas som detektionsprober för histidin rika proteiner.
Histidin rika proteiner och deras regleringsnivåer är viktiga i många sjukdomar, inklusive levercirros, cancer och thrombic störningar. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) i synnerhet är en väl validerad biomarkör för parasitmalariainfektion. Detta protein är 67 kDa och innehåller 34% histidin, främst inom karakteristiska AHHAHHAAD upprepa motiv 19. Dessa histidin upprepningar kan binda fria metalljoner 19 och hem komplex 20 i värd blod. pfHRP-II är vanligen påvisas i inställningarna resurssnåla använder immunokromatografiska snabba diagnostiska test (RDTs), men dessa tester är ofta felaktiga på grund av provförhållanden, låg biomarkör koncentration, dålig tillverkningsnormer, och antikropps nedbrytning 21.
<p class="Jove_content"> Metallbaserad fosforescerande sonder såsom cyclometalated Ir (III) -komplex beskrivna ovan är attraktiva alternativ för detektion av pfHRP-II på grund av deras selektiva bindning av histidin och deras stabila och effektiva emissionsegenskaper. I detta dokument, användning av [Ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) för att detektera BNT-II, en förgrenad peptid efterliknar av pfHRP-II utforskas 22. Kinetik för denna interaktion övervakades i realtid med användning av biolayer Interferometri tekniker. Analysen har också anpassats till en on-kula ELISA-typ format, där nanomolära detektionsgräns uppnåddes. Denna analys har fördelar jämfört med traditionella ELISA, eftersom det kan utföras i enlighet med två h med antikroppsfria reagens, i stället för 4-5 timmar och biologiska reagens som erfordras med typiska ELISA.Som mikropartikelbaserade diagnostikverktyg kommit i förgrunden av modern diagnostisk teknik, är detektion av mål biomolekyler direkt på ytan av partikeln en stor fördel. Traditionella molekylära detektionsmetoder, såsom ELISA och PCR, är fördelaktigt, eftersom de kan uppnå mycket låg detektionsgräns 25. Dessa analyser kräver omfattande reagens och långa protokoll. Denna analys har utformats för att efterlikna ELISA-typ smörgås interaktioner utan tid och reagenskrav (Figur 5). Dessutom har kostnaden för IR1 prob per prov beräknas uppgå till cirka ett öre, medan kostnaden för antikroppar för en typisk ELISA är $ 0,20-0,30 per prov.
Eftersom de förfaranden som beskrivs ovan är beroende av en cyclometalated iridium sond för detektering av malaria biomarkör skulle denna sond inte vara känsliga för felmoder gemensamma för andra detektionsmetoder (dvs.. Fluorofor quenching och antikropp / enzymnedbrytning). Histidin är unik i dess metallbindande egenskaper. Den skisserade arbete tar fördel av detta fenomen genom att ersätta antikropparna i en typisk ELISA-sandwich med metallinnehållande komplex. Ni (II) NTA fångar rcHRP-II på ytan av partikeln och IR1 signalerar närvaron av proteinet. Det mest kritiska steget i analysen tillåter de magnetiska partiklarna att blandas med provet och sonden. I en 96-brunnsplatta ELISA biomolekylerna och reagens når jämvikt med den tvådimensionella ytan på botten av brunnen. Magnetiska partiklar har en tendens att sedimentera ut ur lösningen på grund av deras täta järnoxidkärna, vilket skulle minska de tillgängliga bindningsställen. Sålunda måste partiklarna blandas under analystiden för att säkerställa maximal bindning.
Vid utformningen av ett reagens för diagnostik sjukdom, måste man hålla i minnet form av patientprov samt fysiologiska koncentrationen av biomarkörer. Förmalaria, kan koncentrationen av pf HRP-II i en patients blod variera från låga pikomolära till högt nanomolära. Även om denna analys är kliniskt relevant för högre nivåer av infektion, måste förbättras för att upptäcka symptomfria patienter med låg pikomolar cirkulerande pf HRP-II detektionsgränsen. I de metoder som anges ovan, det "switch-on" signal som genereras av IR1 sker i närvaro av histidin. Medan malaria biomarkör är rik på histidin, andra serumproteiner, såsom humant serumalbumin och histidin glykoprotein, skulle framkalla en svarssignal med sonden. Detta skulle i sin tur leda till falska positiva diagnoser. Detta gör avskiljning av proteinet på ytan av partikeln en välgörande steg, i att proteinet av intresse kan snabbt extraheras från ett patientprov. Dessutom, utforma ett bifunktionellt sond, som kopplar en histidin rik peptid till en robust molekylära igenkänningselement (dvs.. Aptamer), Skulle kunna lägga ytterligare ett lager av specificitet för analysen. Peptiden skulle laddas med iridium innan koppling till aptameren. I en sådan konstruktion kan den stabila IR1 sonden fortfarande utnyttjas samtidigt som man uppnår målspecificitet med aptameren. Detta skulle göra det möjligt för applicering av sonden att detektera nativa HRP-II i en komplex matris (dvs. Plasma eller helblod) och minska ospecifika bindande verkan. I syfte att ytterligare förbättra signalen av snabba diagnostiska tester, kunde analysen införlivas i en elektrokemiluminiscent (ECL) system där pf HRP-II kan detekteras på RDTs som en elektrokemisk avläsning 26. Denna nästa generations iridium sonden skulle avsevärt förbättra vår on-kula ELISA-analys för detektion av sjukdoms biomarkörer.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |