इन विट्रो में और vivo मॉडल में पोत दीवार के नीचे प्रवाह की स्थिति के लिए बैक्टीरियल आसंजन अध्ययन करने के लिए
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
Endovascular संक्रमण और संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ पैदा करने के लिए आदेश में, बैक्टीरिया खून बहने की कतरनी तनाव से अवगत कराया जा रहा है जबकि पोत दीवार का पालन करने में सक्षम होने की जरूरत है।
सूक्ष्मजीवों के संवहनी आसंजन के लिए योगदान है कि बैक्टीरियल और मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए, शारीरिक कतरनी की शर्तों के तहत इन संबंधों का अध्ययन है कि उपयुक्त मॉडल की जरूरत है। यहाँ, हम बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों के लिए बैक्टीरियल आसंजन की जांच करने के लिए या कोशिकाओं endothelial करने की अनुमति देता है कि इन विट्रो प्रवाह चैम्बर मॉडल का वर्णन है, और विकसित किया गया था कि एक intravital माइक्रोस्कोपी मॉडल सीधे vivo में पेटा-संबंधी परिसंचरण को बैक्टीरिया के प्रारंभिक आसंजन कल्पना करने के लिए । इन विधियों प्रवाह के तहत बैक्टीरिया के आसंजन के लिए आवश्यक बैक्टीरियल और मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम कतरनी तनाव की प्रासंगिकता और Staphy के आसंजन के लिए वॉन Willebrand कारक की भूमिका को वर्णनlococcus ऑरियस दोनों में इन विट्रो और इन विवो मॉडल में इस्तेमाल करते हैं।
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
कतरनी तनाव पोत दीवार के लिए जल्दी बैक्टीरियल आसंजन के लिए और Endovascular या endocardial वनस्पति और मेटास्टेटिक संक्रमण 4,5 के बाद की पीढ़ी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। हम शारीरिक कतरनी तनाव के तहत endovascular संक्रमण के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में और vivo मॉडल में पूरक का वर्णन किया। इन मॉडलों हमें प्रमुख एस के रूप में वॉन Willebrand कारक बाध्यकारी प्रोटीन (vWbp) की पहचान करने के लिए अनुमति दी है ऑरियस प्रोटीन VWF 4 को उजागर एक घायल संवहनी दीवार के साथ प्रवाह के तहत बातचीत करने के लिए।
Endovascular संक्रमण, और विशेष रूप से संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ, बल्कि इसलिए भी कि स्थानीय और दूर ('मेटास्टैटिक') जटिलताओं की, क्योंकि न केवल पूति प्रेरित अंग विफलता और मौत की चिंता का विषय हैं। संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ और मेटास्टेटिक संक्रमण पैदा करने के लिए, बैक्टीरिया पोत दीवार का पालन करना और इस प्रकार रक्त बहने की कतरनी तनाव का विरोध किया है। अधिकांशबैक्टीरिया पर अध्ययन कारकों स्थिर परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया है डाह। हालांकि, इन स्थापित बातचीत बैक्टीरिया मेजबान परस्पर क्रिया में नया, पहले से अपरिचित कारकों प्रकट कर सकते हैं प्रवाह शर्तों के तहत कतरनी बलों और पढ़ाई का सामना नहीं कर सकता है।
माइक्रो समानांतर प्रवाह कक्ष का उपयोग करना, और हम दूसरों संवहनी आसंजन के लिए VWF के महत्व को दिखाया गया है। कतरनी तनाव के तहत, उत्तरोत्तर करेंगी आराम कर अपनी गोलाकार संरचना से VWF, और उसके GPIB रिसेप्टर 6 के माध्यम से प्लेटलेट्स के साथ सूचना का आदान प्रदान A1 के डोमेन को उजागर करता है। प्रवाह कक्षों बड़े पैमाने पर प्लेटलेट समारोह 7 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
उल्लेखनीय है, यह भी एस प्रवाह के तहत ऑरियस आसंजन कतरनी पर सामने आ रहा है कि ए 1 डोमेन VWF आवश्यकता है, और विशेष रूप से। हम vWbp VWF बाध्यकारी मध्यस्थता की पहचान की। vWbp एस के लिए योगदान देता है कि एक coagulase है मेजबान के प्रोथ्रोम्बिन सक्रिय द्वारा ऑरियस pathophysiology। Staphylothrombin, Resएक जीवाणु coagulase और प्रोथ्रोम्बिन की जटिल ulting, अघुलनशील आतंच 8,9 में फाइब्रिनोजेन धर्मान्तरित। हमारे अध्ययन vWbp केवल प्रोथ्रोम्बिन सक्रिय नहीं करता है कि दिखाया गया है, लेकिन प्रवाह 4,10,11 के तहत रक्त वाहिकाओं के लिए आसंजन बढ़ाने के जो बैक्टीरिया-आतंच प्लेटलेट समुच्चय, का गठन हो सके है।
इन विट्रो प्रवाह चैम्बर मॉडल सेलुलर या मैट्रिक्स घटकों के लिए बैक्टीरियल आसंजन में विभिन्न खिलाड़ियों के अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। बैक्टीरियल विषैलापन कारकों विशिष्ट सतह प्रोटीन व्यक्त म्यूटेंट या अहानिकर बैक्टीरिया का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, pharmacologic inhibitors या अवरुद्ध एंटीबॉडी प्रवाह कक्ष में माध्यम से जोड़ा जा सकता है। ऐसे बाह्य मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों के रूप में मेजबान कारकों की भूमिका अलग कोटिंग्स के साथ coverslips का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। coverslips के भी सक्रियण स्थिति विशिष्ट stimulators जोड़कर संग्राहक किया जा सकता है, जिनमें से endothelial कोशिकाओं के साथ कवर किया जा सकता है। आपासंवहनी दीवार से आर टी, मेजबान रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा प्रोटीन का योगदान बह मध्यम करने के लिए इन कारकों को जोड़कर अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रकार, बढ़ती जटिलता के विभिन्न स्थितियों बैक्टीरिया विवो में पोत दीवार का पालन करने की अनुमति देते हैं कि बातचीत को जानने के लिए लामिना का प्रवाह के मानकीकृत शर्तों के अधीन अध्ययन किया जा सकता है।
इन विट्रो मॉडल में पहचान की सहभागिता बाद में एक जटिल जीव में उनकी प्रासंगिकता का परीक्षण करने के लिए एक पशु मॉडल में अध्ययन कर रहे हैं। प्रवाह के तहत गतिशील बातचीत का अध्ययन करने के लिए vivo मॉडल में अन्य ऐसे हैम्स्टर पृष्ठीय skinfold चैम्बर 12 और cremaster मॉडल के रूप में 13, वर्णित किया गया है। इसकी तुलना में, यहाँ वर्णित mesenteric छिड़काव मॉडल, संभावना चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि की मेजबानी भिन्न करने के लिए और औषधीय हस्तक्षेप का मूल्यांकन करने के लिए, क्योंकि प्रयोग के अपने आसानी के कई लाभ प्रदान करता है।
अंत में, मॉडल वर्णितएस की न केवल सतह प्रोटीन अध्ययन करने की संभावना की पेशकश ऑरियस, लेकिन अलग मेजबान पृष्ठभूमि में कई अन्य सूक्ष्मजीवों के बेहतर नाड़ी संक्रमण के रोगजनन को समझने के लिए।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम Fonds वूर Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N द्वारा समर्थित किया गया था; बाल चिकित्सा कार्डियोलॉजी, UZ बेल्जियम, बेल्जियम के लिए "एड़ी Merckx अनुसंधान अनुदान" और "Sporta अनुसंधान अनुदान" (जे.सी.); आण्विक और संवहनी जीवविज्ञान के लिए केंद्र लोवेन विश्वविद्यालय से "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (गोवा 2009/13) और बोहरिंगर-Ingelheim से एक शोध अनुदान से, Programmafinanciering केयू लोवेन (पीएफ / 10/014) के द्वारा समर्थित है।
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
Referências
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