Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Summary

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Abstract

A gravidez é caracterizada pela infiltração de leucócitos nos tecidos reprodutivos e na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal). Essa interface é o sítio anatômico de contato entre mãe e tecidos fetais; por conseguinte, é um local de acção imunológica durante a gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal de desempenhar um papel central na implantação, manutenção da gravidez, e tempo de entrega. Portanto, caracterizações fenotípicas e funcionais desses leucócitos irá fornecer insights sobre os mecanismos que levam a distúrbios de gravidez. Vários protocolos têm sido descritos, a fim de isolar a partir de leucócitos de infiltração a decídua basal e parietal decidua; no entanto, a falta de coerência nos reagentes, enzimas, e os tempos de incubação torna difícil comparar estes resultados. Descreve-se aqui uma nova abordagem que combina a utilização de Diss mecânicas e enzimáticas suavesociation técnicas para preservar a viabilidade e a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Seguindo este protocolo, os leucócitos isolados podem ser usados ​​para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro de leucócitos (isto é, a fagocitose, a citotoxicidade, proliferação de células T, e plasticidade, etc), e a produção de espécies reactivas de oxigénio na interface materno-fetal. Além disso, utilizando o protocolo descrito, este laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.

Introduction

A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um "ferida aberta"); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório ^1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez

Protocol

Este protocolo é apropriado para o isolamento de leucócitos dos decídua basal e parietalis decídua em preparação para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Além disso, as células isoladas podem ser utilizadas para selecção de células, cultura de células, o isolamento de RNA, e citologia. Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética humana deve ser obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa local e Conselhos de Revisão Institucional. A recolha e utilização de amostras humanas para fins de investigação foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (....

Results

. A dissecção de tecidos humanos na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal) é mostrado na Figura 1 Este procedimento inclui a dissecção da placa basal, que inclui os decídua basal (Figura 1A - D). A decídua basal é obtido pela remoção da vilosidade placentário (lado fetal) a partir da placa basal (Figura 1C). A parietal decidua é recolhido por raspagem suave da membrana coriónica (Figura 1E - F). A Figura 2

Discussion

Caracterização das propriedades funcionais e fenotípicas de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humana é essencial para a compreensão dos mecanismos imunes que levam a desordens gravidez. Diversas técnicas têm sido descritas, a fim de isolar leucócitos da interface materno-fetal humano durante a gravidez ^{10,14,25,28,37,42,43.} No entanto, cada uma destas técnicas é distinto, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não especifica quantidade.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Ferramentas de dissecação estéreis: tesouras cirúrgicas, pinças e pinças de ponta fina	Qualquer fornecedor	20012-027
1X solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Grandes e pequenas placas de Petri	Qualquer fornecedor
Dissociação
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(solução de desprendimento celular)
Tubos cônicos estéreis de 2 ml com trava segura	Qualquer
de tubos de centrífuga cônicos de 50 ml	Qualquer fornecedor
100 µ filtros de células m	FALCON/Corning	352360
Tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 ml	Pipetas
Tubos	qualquer fornecedor
	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS e 1% P/S)
Corrediças de câmara de plástico	Incubadora	177437
	Thermo Scientific Corporation	HEPA Classe 100
Banho-maria	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Contador de células	Microscópio	Nexelcom Cellometer Auto2000
	Olympus	Olympus CKX41
Separação de células
MS colunas	Miltenyi Biotec	130-042-201
Separador de células	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μ m filtros de pré-separação	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Tubos cônicos de trava segura de 15 ml	Qualquer fornecedor
Tampão MACS			(0,5% de albumina de soro bovino, 2 mM EDTA e 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-anticorpos anti-antígeno de superfície celular humana	BD Biosciences		(Tabela 1)
Albumina de soro bovino	Sigma	A7906
LIVE/DEAD corante de viabilidade	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
buffer FACS			(0,1% BSA, 0,05% Azida de Sódio, e 1X PBS, pH=7,4)
Tampão de coloração	BD Biosciences	554656
solução Trypan Blue 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Mídia de gradiente de densidade de 20% (1.077 + 0.001 g/ml)
Instrumentos Adicionais
Incubadora com agitador	Citômetro	Thermo Scientific MAXQ 4450
	Centrífuga BD Biosciences	LSR-Fortessa
	Beckman Coulter	SpinChron DLX
	Qualquer fornecedor
Dissociador automático de tecidos	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator