Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Zwangerschap wordt gekenmerkt door de infiltratie van leukocyten in de reproductieve weefsels en de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis). Deze interface is de anatomische plaats van contact tussen moeder en foetale weefsels; Daarom is het een immunologisch werkingsplaats tijdens de zwangerschap. Infiltreren leukocyten bij de moeder-foetale-interface spelen een centrale rol in de implantatie, zwangerschap onderhoud, en de timing van de levering. Daarom zal fenotypische en functionele karakteriseringen van deze leukocyten inzicht in de mechanismen die leiden tot zwangerschap stoornissen. Verscheidene protocollen zijn beschreven om te isoleren infiltrerende leukocyten uit de decidua basalis en decidua parietalis; echter, het gebrek aan consistentie in de reagentia, enzymen en tijden van incubatie is het moeilijk deze resultaten te vergelijken. Hierin beschreven is een nieuwe benadering die het gebruik van zachte mechanische en enzymatische diss combineertociation technieken om de levensvatbaarheid en integriteit van extracellulaire en intracellulaire markers in leukocyten geïsoleerd uit menselijke weefsels op de maternale-foetale-interface behouden. Afgezien van immunofenotypering, celcultuur en celsortering, de toekomstige toepassingen van dit protocol zijn talrijk en gevarieerd. Na dit protocol kan de geïsoleerde leukocyten worden gebruikt om DNA-methylering, expressie van doelwitgenen in vitro leukocyten functionaliteit (dat wil zeggen, fagocytose, cytotoxiciteit, T-celproliferatie en plasticiteit, etc.), en de productie van reactieve zuurstofsoorten te bepalen de maternale-foetale interface. Bovendien, met behulp van de beschreven protocol, dit laboratorium is in staat om nieuwe en zeldzame leukocyten te beschrijven op de maternale-foetale-interface geweest.

Introduction

Zwangerschap vertoont drie verschillende immunologische fasen: 1) implantatie en vroege placentatie geassocieerd met pro-inflammatoire respons (bijv implantatie lijkt op een open wonde "); 2) het tweede trimester en de meeste derde trimester van de zwangerschap wanneer immuunhomeostase wordt bereikt door een overwegend anti-inflammatoire staat in het maternale-foetale interface; en 3) de bevalling, een pro-inflammatoire staat ^1-7. Immune cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van de ontstekingsreactie bij de moeder-foetale interface waar hun overvloed en lokalisatie veranderingen tijdens de zwangerschap ^6-9.

Bij de mens, de moeder-foetale-interface vertegenwoordigt een gebied van direct contact tussen de moeder (decidua) en foetale (chorion of trofoblast) weefsels. Deze interface bevat: 1) de decidua parietalis die lijnen de baarmoederholte niet onder de placenta en naast elkaarhet chorion laeve; en 2) de decidua basalis, gelegen in de basale plaat van de placenta indien het wordt aangevallen door interstitiële trofoblasten ¹⁰ (figuur 1). De intimiteit van deze gebieden van contact schept voorwaarden voor de foetus antigene blootstelling aan de maternale immuunsysteem ^11-13. Niet verrassend, leukocyten bevatten tot 30-40% van de deciduale cellen ^8,9,14,15 in aanvulling op de typische stromale-type cellen en kliercellen ^8,14,16. De rol van leukocyten bij de moeder-foetale-interface omvat meerdere processen dat de beperking van trofoblastinvasie ^17, herinrichting van spiraal arteriën ^18,19, het onderhoud van maternale tolerantie ^12,20, en initiatie van arbeid ^21-26 bevatten. Leukocyten van zowel het adaptieve en aangeboren onderdeel van het immuunsysteem, dat wil zeggen, T-cellen, macrofagen, neutrofielen, B cellen, dendritische cellen en NK-cellen, geïdentificeerd in de deciduale weefsel en deverhoudingen en activatie toestand werden aangetoond in ruimte en tijd variëren gedurende dracht ^{6-10,12,14,24,27-30.} Verstoringen in de leukocyten populatie en / of functie worden geassocieerd met spontane abortus ^{31, 32} pre-eclampsie, geboortegewicht ^32,33 en vroeggeboorte ^7,24. Daarom zal de studie van de fenotypische kenmerken en functionaliteit van leukocyten op menselijk maternale-foetale interface van de opheldering van de immunologische pathways verstoord bij zwangerschap stoornissen vergemakkelijken.

Een van de meest krachtige hulpmiddelen gebruikt om het fenotype en de functionele eigenschappen van leukocyten te bepalen wordt flowcytometrie technologie die de kwantitatieve analyse van meerdere parameters tegelijkertijd ^34-36 toelaat. Leukocyten door middel van flowcytometrie geanalyseerd, wordt isolatie van de leukocyten in een enkelvoudige celsuspensie vereist. Daarom is een werkwijze te scheiden infiltreren leukocytes van de maternale-foetale interface komen hun fenotypische en functionele eigenschappen te bestuderen.

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven om leukocyten te isoleren uit de humane maternale-foetale-interface ^{10,14,25,27,37-39.} Terwijl sommige van toepassing mechanische uitsplitsing ^10,25,27,38, anderen gebruiken enzymatische afbraak ^37,40 voor weefsel dissociatie. Omdat mechanische disaggregatie opbrengst wel lager en verminderde levensvatbaarheid ⁴¹ en enzymatische dissociatie kunnen levensvatbaarheid en celoppervlaktemarker retentie ⁴² invloed op de hierin beschreven methode combineert zachte mechanische dissociatie met enzymatische voorbehandeling om de opbrengst van geïsoleerde leukocyten verhogen zonder afbreuk cellevensvatbaarheid. Een soortgelijke combinatie van methoden is aangetoond effectief bij het ​​isoleren van leukocyten uit het deciduale weefsel van de maternale-foetale-interface ³⁹ zijn. Daarom is het hierin beschreven protocol omvat mechanisch disaggregatie met een automatische weefsel dissociator dat consistentie verhoogt terwijl bespaart tijd en arbeid in vergelijking met de traditionele hakken met tegengestelde scalpels, scheermesjes, of chirurgische schaar ^10,28. De gekozen voor weefsel dissociatie enzym was Accutase. In tegenstelling tot veel gebruikte collagenase ^43, dispase ⁴⁴ en trypsine ^45, Accutase (een cel onthechting oplossing) combineert zowel algemene proteolytische en collagenolytische activiteiten die bijdragen aan een efficiënte en toch zachte dissociatie ^46,47. Na dissociatie, worden de leukocyten verrijkte van de totale bevolking van de decidua cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Verschillende dichtheidsgradiënt media zijn eerder toegepast, de meest voorkomende daarvan zijn Percoll (een suspensie van colloïdale silicadeeltjes) ⁴⁸ en Ficoll (een polymeer van sucrose met een hoog molecuulgewicht synthetisch) ^49. De superieure efficiency van isolatie door de sucrose polymeer previo geweestusly getoond ⁵⁰ en de hierin verder beschreven protocol bewijst dat deze dichtheidsgradiënt media produceert een voldoende hoge zuiverheid van mononucleaire leukocyten.

Vandaar dat de hierin beschreven protocol combineert de mechanische weefsel disaggregatie met automatisch dissociator weefsel, enzymatische digestie met een mobiele onthechting oplossing en leukocyten scheiden met een dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) om leukocyten uit menselijk deciduale weefsel te isoleren. Is bewezen dit protocol om celoppervlakantigenen behouden samen met levensvatbaarheid van de cellen. De geïsoleerde leukocyten kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen immunofenotypering met flowcytometrie en functionele studies in vitro omvatten.

Protocol

Dit protocol is geschikt voor leukocyt los van de decidua basalis en decidua parietalis ter voorbereiding immunofenotypering met flowcytometrie. Verder kunnen de geïsoleerde cellen worden gebruikt voor celsortering, celkweek, RNA-isolatie en cytologie. Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet de mens ethische goedkeuring worden verkregen van de lokale Research Ethics Committee en Institutional Review Boards. De verzameling en het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden werden goe…

Representative Results

. De ontleding van menselijke weefsels op de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis) wordt in figuur 1 Deze werkwijze omvat het ontleden van de basale plaat, waarbij de decidua basalis (Figuur 1A – D) omvat. De decidua basalis wordt verkregen door verwijdering van de placenta villi (foetale zijde) van de basale plaat (figuur 1C). De decidua parietalis wordt verzameld door voorzichtig schrapen het chorion membraan (Fig…

Discussion

Karakterisering van het functionele en fenotypische eigenschappen van infiltrerende leukocyten op menselijk maternale-foetale interface is essentieel voor het begrip van de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap aandoeningen. Er zijn verschillende technieken beschreven om leukocyten uit de humane maternale-foetale-interface isoleren gedurende de zwangerschap ^{10,14,25,28,37,42,43.} Echter, elk van deze technieken verschilt, gebruikt verschillende enzymen of enzym-combinaties, vereist verschillende disso…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator