मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से leukocytes की अलगाव
Summary
Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Abstract
गर्भावस्था प्रजनन ऊतकों में और मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स (पत्या basalis और पत्या parietalis) की घुसपैठ की विशेषता है। इस इंटरफ़ेस मातृ एवं भ्रूण के ऊतकों के बीच संपर्क के संरचनात्मक साइट है; इसलिए, यह गर्भावस्था के दौरान कार्रवाई की एक प्रतिरक्षाविज्ञानी साइट है। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स प्रसव के एक केंद्रीय आरोपण में भूमिका, गर्भावस्था के रखरखाव, और समय खेलते हैं। इसलिए, इन leukocytes के प्ररूपी और कार्यात्मक अभिलक्षण गर्भावस्था से जुड़ी समस्याओं के लिए नेतृत्व कि तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। कई प्रोटोकॉल पत्या basalis और पत्या parietalis से ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ को अलग करने के क्रम में वर्णित किया गया है; हालांकि, ऊष्मायन के अभिकर्मकों, एंजाइमों, और कई बार में निरंतरता की कमी के कारण यह मुश्किल है कि इन परिणामों की तुलना करने के लिए बनाता है। यहाँ बताया कोमल यांत्रिक और enzymatic जे के प्रयोग को जोड़ती है कि एक उपन्यास दृष्टिकोण हैociation तकनीक मातृ-भ्रूण इंटरफेस में मानव ऊतकों से अलग ल्यूकोसाइट्स में बाह्य और intracellular मार्कर की व्यवहार्यता और अखंडता की रक्षा करने के लिए। एक तरफ immunophenotyping, सेल संस्कृति, और सेल छँटाई से, इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के कई और विविध हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद, अलग ल्यूकोसाइट्स डीएनए इन विट्रो ल्युकोसैट कार्यक्षमता (यानी, phagocytosis, cytotoxicity, टी-सेल प्रसार, और plasticity, आदि) में मेथिलिकरण, लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मातृ-भ्रूण इंटरफेस में। इसके अतिरिक्त, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, इस प्रयोगशाला मातृ-भ्रूण इंटरफेस में नए और दुर्लभ ल्यूकोसाइट्स वर्णन करने में सक्षम हो गया है।
Introduction
गर्भावस्था के तीन अलग प्रतिरक्षात्मक चरणों की विशेषता है: 1) आरोपण और एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया से जुड़े जल्दी गर्भनाल (यानी, आरोपण 'एक खुला घाव' जैसा दिखता है); 2) दूसरी तिमाही और प्रतिरक्षा homeostasis को मातृ-भ्रूण इंटरफेस में एक मुख्य रूप से विरोधी भड़काऊ राज्य के माध्यम से हासिल की है जब गर्भावस्था की तीसरी तिमाही की सबसे; और 3) प्रसव, एक समर्थक भड़काऊ राज्य 1-7। इम्यून कोशिकाओं को मातृ-भ्रूण इंटरफेस में भड़काऊ प्रतिक्रिया के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जहां उनकी बहुतायत और गर्भावस्था 6-9 भर स्थानीयकरण बदल जाते हैं।
इंसानों में, मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस मातृ (पत्या) और भ्रूण (जरायु या ट्रोफोब्लास्ट) ऊतकों के बीच सीधे संपर्क के एक क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। 1) पत्या लाइनों गर्भाशय गुहा नाल द्वारा कवर नहीं है कि parietalis और मुक़ाबला में है: यह इंटरफ़ेस शामिलजरायु laeve करने के लिए; और 2) यह मध्य trophoblasts 10 (चित्रा 1) द्वारा आक्रमण किया जहां नाल के बेसल थाली में स्थित पत्या basalis। संपर्क के इन क्षेत्रों की अंतरंगता मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली को 11-13 भ्रूण प्रतिजनी लोगों तक पहुंचाने के लिए शर्तों बनाता है। आश्चर्य नहीं कि ल्यूकोसाइट्स ठेठ स्ट्रोमल प्रकार की कोशिकाओं और ग्रंथियों के कोशिकाओं 8,14,16 के अलावा decidual कोशिकाओं 8,9,14,15 का 30-40% तक शामिल हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस में leukocytes की भूमिका ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 17 की सीमा, सर्पिल धमनियों 18,19 के पुनर्गठन, मातृ सहिष्णुता 12,20 के रखरखाव, और श्रम 21-26 की दीक्षा भी शामिल है कि कई प्रक्रियाओं शामिल हैं। अनुकूली और IE, टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, बी कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और एन.के. कोशिकाओं, decidual ऊतकों में पहचान की गई है प्रतिरक्षा प्रणाली, के जन्मजात अंग है, और उनके दोनों की Leukocytesअनुपात और सक्रियण स्थिति हमल 6-10,12,14,24,27-30 भर spatially और अस्थायी भिन्न करने के लिए दिखाया गया है। ल्युकोसैट आबादी और / या समारोह में perturbations सहज गर्भपात 31 प्राक्गर्भाक्षेपक 32, अंतर्गर्भाशयी विकास प्रतिबंध 32,33, और अपरिपक्व श्रम 7,24 के साथ जुड़े रहे हैं। इसलिए, मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में प्ररूपी विशेषताओं और leukocytes की कार्यक्षमता का अध्ययन गर्भावस्था के विकारों में dysregulated प्रतिरक्षात्मक रास्ते की व्याख्या की सुविधा होगी।
एकाधिक मापदंडों एक साथ 34-36 के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि प्रवाह cytometry है phenotype और leukocytes के कार्यात्मक संपत्तियों का निर्धारण किया सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक, प्रौद्योगिकी। फ्लो द्वारा ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए, एक एकल कोशिका निलंबन में leukocytes के अलगाव की आवश्यकता है। इसलिए, एक विधि लियू घुसपैठ अलग करने के लिएमातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस से kocytes उनके प्ररूपी और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने की जरूरत है।
कई तरीकों मानव मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 10,14,25,27,37-39 से ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। कुछ यांत्रिक disaggregation 10,25,27,38 लागू होते हैं, दूसरों के ऊतक हदबंदी के लिए enzymatic पाचन 37,40 का उपयोग करें। मैकेनिकल disaggregation एक कम पैदावार और कम व्यवहार्यता 41, और व्यवहार्यता और कोशिका की सतह मार्कर प्रतिधारण 42 प्रभावित कर सकते हैं एंजाइमी हदबंदी पैदा करता है, क्योंकि इस के साथ साथ वर्णित विधि सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना पृथक leukocytes की उपज बढ़ाने के लिए एंजाइमी पूर्व उपचार के साथ कोमल यांत्रिक हदबंदी को जोड़ती है। विधियों की एक समान संयोजन मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस 39 पर decidual ऊतकों से leukocytes के अलगाव में प्रभावी होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल व्यवस्था शामिल हैविरोध करने नलियां, रेज़र ब्लेड, या शल्य कैंची 10,28 के साथ परंपरागत क़ीमा बनाने की तुलना में जब समय और श्रम की बचत करते हुए स्थिरता बढ़ जाती है कि एक स्वत: ऊतक dissociator साथ nical disaggregation। ऊतक हदबंदी के लिए चुना एंजाइम Accutase था। आमतौर पर इस्तेमाल किया collagenase 43 के विपरीत, 44 dispase, और trypsin 45, Accutase (एक सेल टुकड़ी समाधान) सामान्य प्रोटियोलिटिक और कुशल अभी तक कोमल हदबंदी 46,47 कि योगदान करने के collagenolytic गतिविधियों दोनों को जोड़ती है। हदबंदी के बाद, ल्यूकोसाइट्स घनत्व ढाल centrifugation द्वारा decidual कोशिकाओं की कुल आबादी से समृद्ध कर रहे हैं। विभिन्न घनत्व ढाल मीडिया पहले से Percoll (कोलाइडयन सिलिका कणों का एक निलंबन) 48 और Ficoll (एक उच्च कृत्रिम आणविक वजन के साथ sucrose के एक बहुलक) 49 सबसे आम है, जिनमें से उपयोग किया गया है। सूक्रोज बहुलक से अलगाव की बेहतर दक्षता previo कर दिया गया हैusly 50 दिखाया गया है, और इस के साथ साथ आगे वर्णित प्रोटोकॉल इस घनत्व ढाल मीडिया मोनोन्यूक्लियर leukocytes के एक पर्याप्त उच्च शुद्धता है कि उत्पादन साबित होता है।
इसलिए, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मानव decidual ऊतकों से ल्यूकोसाइट्स अलग करने के लिए एक घनत्व ढाल मीडिया (1.077 + 0.001 ग्राम / एमएल) के साथ एक स्वचालित ऊतक dissociator, एक सेल टुकड़ी समाधान के साथ enzymatic पाचन, और ल्युकोसैट जुदाई के साथ यांत्रिक ऊतक disaggregation को जोड़ती है। इस प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता के साथ कोशिका की सतह एंटीजन संरक्षित करने के लिए सिद्ध किया गया है। पृथक ल्यूकोसाइट्स फ्लो और इन विट्रो में कार्यात्मक पढ़ाई के साथ immunophenotyping शामिल है कि कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के कार्यात्मक और प्ररूपी गुणों की विशेषता गर्भावस्था से जुड़ी समस्याओं के लिए नेतृत्व कि प्रतिरक्षा तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। कई तकनीकों गर्भ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट, एनआईएच / DHHS द्वारा समर्थित किया गया। यह काम भी मातृ, प्रसवकालीन और बाल स्वास्थ्य में वेन स्टेट यूनिवर्सिटी प्रसवकालीन पहल से, भाग में, का समर्थन किया था। हम कृतज्ञता पांडुलिपि की उसके आलोचकों की रीडिंग के लिए मॉरीन McGerty (वेन स्टेट यूनिवर्सिटी) स्वीकार करते हैं।
Materials
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
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